張先鋒，黃遠見，肖 娟，張志偉，黃衛(wèi)國

421001 湖南省衡陽市，南華大學附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(張先鋒，黃遠見，肖娟，張志偉，黃衛(wèi)國)；南華大學腫瘤研究所(張志偉，黃衛(wèi)國)

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·論著·

微小RNA-150對鼻咽癌細胞放療抵抗的影響研究

張先鋒，黃遠見，肖 娟，張志偉，黃衛(wèi)國

421001 湖南省衡陽市，南華大學附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(張先鋒，黃遠見，肖娟，張志偉，黃衛(wèi)國)；南華大學腫瘤研究所(張志偉，黃衛(wèi)國)

【摘要】目的探討微小RNA(miR)-150對于鼻咽癌細胞放療抵抗的影響，并分析其機制。方法2014年1月—2015年6月，建立放療抵抗的鼻咽癌細胞株CNE-2R。取CNE-2和CNE-2R，通過克隆形成實驗計算不同放療劑量下(0、3、6 Gy)的克隆形成率(PE)、細胞存活率，采用MTS法檢測照射1、2、3、4、5 d時的細胞增殖活性，實時定量熒光聚合酶鏈式反應(yīng)(Real-time PCR)法檢測miR-150、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)mRNA水平，Western blotting法檢測GSK3β水平。將CNE-2隨機分為miR-150模擬物組(轉(zhuǎn)染miR-150模擬物)、微小RNAs(miRs)無關(guān)序列組(轉(zhuǎn)染miRs無關(guān)序列)，通過熒光素酶報告載體實驗檢測熒光素酶活性。結(jié)果0 Gy放療劑量時，CNE-2與CNE-2R的PE、細胞存活率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；3 Gy、6 Gy放療劑量時，CNE-2R的PE、細胞存活率高于CNE-2(P<0.05)。照射1～5 d時，CNE-2R的細胞增殖活性高于CNE-2(P<0.05)。CNE-2R中miR-150水平高于CNE-2，GSK3β mRNA水平低于CNE-2(P<0.05)。CNE-2R中GSK3β水平低于CNE-2(P<0.05)。轉(zhuǎn)染GSK3β野生型質(zhì)粒后，miR-150模擬物組熒光素酶活性低于miRs無關(guān)序列組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染GSK3β突變型質(zhì)粒后，miRs無關(guān)序列組與miR-150模擬物組熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論miR-150參與了鼻咽癌細胞的放療抵抗，GSK3β是miR-150的直接靶基因，miR-150-GSK3β軸可能成為一種新的用于合理治療鼻咽癌的策略。

【關(guān)鍵詞】鼻咽腫瘤；放射療法；微小RNA-150；糖原合成酶激酶類

張先鋒，黃遠見，肖娟，等.微小RNA-150對鼻咽癌細胞放療抵抗的影響研究[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(12)：1424-1428.[www.chinagp.net]

Zhang XF,Huang YJ,Xiao J,et al.Influence of miR-150 on the radioresistance of nasopharyngeal carcinoma cells[J].Chinese General Practice，2016，19(12)：1424-1428.

鼻咽癌是一種具有較強局部侵襲力以及早期轉(zhuǎn)移特點的惡性腫瘤，由于其解剖位置特殊且對放射線較為敏感，放療是其最重要的治療方法。然而，放療抵抗仍然是鼻咽癌治療中的一大難題[1-3]。微小RNAs(miRs)是一類內(nèi)源性的短的保守的非編碼RNA，其通過與mRNA的3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)特異結(jié)合使之降解或者抑制其翻譯，從而調(diào)控相關(guān)靶基因的表達[4-5]。miRs在許多人類癌癥中發(fā)揮著原癌基因或腫瘤抑制基因的作用[6]。一些miRs已被證實與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如微小RNA(miR)-141、miR-218、miR-26a[7-9]。然而，miRs在鼻咽癌細胞放療抵抗中所發(fā)揮的作用至今鮮有報道。本研究探討miR-150對于鼻咽癌細胞放療抵抗的影響，并分析其機制，以期為合理制定鼻咽癌治療策略提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1細胞來源鼻咽癌細胞株CNE-2為低分化細胞株，購置于上海細胞研究所，由南華大學腫瘤研究所保存。

1.2主要材料miR-150模擬物及miRs無關(guān)序列購自Ambion公司；野生型質(zhì)粒與突變型質(zhì)粒由廣州復能基因有限公司構(gòu)建；糖原合成酶激酶3β(GSK3β)抗體購自Santa Cruz Biotechnology；β-actin抗體購自CST公司；山羊抗小鼠(HRP)二抗購自Thermo公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen生命技術(shù)公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；CellTiter 96?AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒購自Promega公司；ELx800酶標儀購自美國BioTek公司；miRNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA Bio-Tek公司；miScript Ⅱ RT Kit、SYBR Green PCR試劑盒購自QIAGEN。

1.3研究方法

1.3.1建立放療抵抗的鼻咽癌細胞株CNE-2R與細胞培養(yǎng)2014年1月—2015年6月，建立放療抵抗的鼻咽癌細胞株CNE-2R：取對數(shù)生長期的鼻咽癌細胞株CNE-2，予以依次遞增的放療劑量(1、2、4、6、8 Gy)照射，每個劑量至少照射3次，直到細胞增殖到80%再進行下一個劑量的照射，該階段共12個月。CNE-2和CNE-2R培養(yǎng)于含10%新生胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)，每1～2 d更換1次培養(yǎng)基，取生長良好的CNE-2及CNE-2R用于本實驗。

本研究創(chuàng)新點：

鼻咽癌是發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，由于其發(fā)生部位的特殊性，放射治療是鼻咽癌的首選治療方法。鼻咽癌的治療失敗常與放療抵抗相關(guān)。微小RNAs(miRs)是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，一些miRs已被證實與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，然而，miRs在鼻咽癌放療抵抗中所發(fā)揮的作用至今鮮有報道。本文通過比較放療抵抗的鼻咽癌細胞株CNE-2R與鼻咽癌細胞株CNE-2，發(fā)現(xiàn)CNE-2R中微小RNA(miR)-150表達上調(diào)，糖原合成酶激酶3β(GSK3β)表達下調(diào)，GSK3β是miR-150的靶基因，提示miR-150可通過靶向抑制GSK3β的表達來調(diào)控鼻咽癌細胞的放療抵抗。本研究豐富了人們對miRs在鼻咽癌放療抵抗中作用的認識，為預(yù)測鼻咽癌細胞放療抵抗提供了線索，具有一定的創(chuàng)新性和價值。

1.3.2克隆形成實驗用0.125%的胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的CNE-2和CNE-2R，制成單細胞懸液，以2 000個/孔接種于6孔板中，隔夜待細胞貼壁后，分別用0、3、6 Gy放療劑量滿射野照射，繼續(xù)培養(yǎng)15 d，棄去培養(yǎng)液，0.9%氯化鈉溶液洗滌2次，10%甲醇溶液固定15 min，然后去除固定液，使用0.06%結(jié)晶紫試劑染色。用顯微鏡觀察，計數(shù)細胞團數(shù)(>50個細胞，克隆數(shù))，計算克隆形成率(PE)〔PE=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%〕。以0 Gy放療劑量的克隆形成率為對照，計算細胞存活率(細胞存活率=觀察組PE/對照組PE×100%)。實驗獨立重復3次，取均值。

1.3.3MTS法檢測細胞增殖活性采用MTS法檢測細胞增殖活性，按照CellTiter 96?AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒說明書進行操作。收集生長良好的CNE-2和CNE-2R，分別制成單細胞懸液后，以2 000個/孔(0.20 ml/孔)接種到96孔板中，以3 Gy放療劑量進行照射。分別在1、2、3、4、5 d時加入MTS(0.02ml/孔)，孵育2 h后，用ELx800酶標儀測定每孔在490 nm處的吸光度(OD值)，根據(jù)OD值判定細胞增殖活性。實驗獨立重復3次，取均值。

1.3.4實時定量熒光聚合酶鏈式反應(yīng)(Real-time PCR)法檢測miR-150、GSK3β mRNA水平取適量CNE-2及CNE-2R，采用miRNA提取試劑盒提取純化miRs，利用miScript Ⅱ RT Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBR Green PCR試劑盒說明書進行Real-time PCR操作。miR-150正向引物：5′-UAUACAAAACAAGCUGUC

UGUTT-3′，反向引物：5′-ACAGCCGCUUGCCCGUUG

UCGCTT-3′；U6正向引物：5′-UUCUCCGAACGUGU

CACGUTT-3′，反向引物：5′-ACGUGACACGUUCGG

AGAATT-3′；GSK3β正向引物：5′-GACTAAGGTCTTCCGACCCC-3′，反向引物：5′-TTAGCATCTGACGCTGCTGT-3′；GAPDH正向引物：5′-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3′，反向引物：5′-TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3。在Real-time PCR儀內(nèi)進行PCR擴增，反應(yīng)體系為20 μl：包括稀釋后的RT產(chǎn)物2 μl、2×qRT-PCR緩沖液10 μl、5 μmol/L特異性PCR引物0.4 μl、5 U/μl耐熱DNA聚合酶0.2 μl、滅菌雙蒸水7.4 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min活化Taq酶，95 ℃ 12 s、62 ℃ 35 s，共40個循環(huán)；熔解曲線檢測從62 ℃開始至95 ℃停止。檢測miR-150水平時，以U6作為內(nèi)參；檢測GSK3β mRNA水平時，以GAPDH作為內(nèi)參。實驗獨立重復3次，取均值。

1.3.5Western blotting法檢測GSK3β水平收集CNE-2及CNE-2R，加入RIPA細胞裂解液以及蛋白酶抑制劑，提取細胞總蛋白，采用BCA法對蛋白水平進行測定。分別取等量CNE-2、CNE-2R蛋白，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在含5%脫脂牛奶的三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖溶液中封閉，加入β-actin抗體以及GSK3β抗體，4 ℃過夜，洗膜，加入HRP二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜30 min，然后加入發(fā)光劑，X片曝光、顯影、定影。

1.3.6細胞轉(zhuǎn)染用胰蛋白酶對CNE-2及CNE-2R進行消化，將細胞計數(shù)并接種在96孔板中。CNE-2及CNE-2R分別隨機分為miR-150模擬物組(轉(zhuǎn)染miR-150模擬物)、miRs無關(guān)序列組(轉(zhuǎn)染miRs無關(guān)序列)，兩組再分別轉(zhuǎn)染GSK3β野生型質(zhì)粒、GSK3β突變型質(zhì)粒。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將濃度均為100 nmol/L的miR-150模擬物、GSK3β野生型質(zhì)粒、GSK3β突變型質(zhì)粒以及miRs無關(guān)序列轉(zhuǎn)染至細胞。在轉(zhuǎn)染36 h后，進行后續(xù)實驗。

1.3.7熒光素酶報告載體實驗檢測熒光素酶活性根據(jù)GSK3β 3′UTR序列與miR-150結(jié)合位點設(shè)計合成野生型引物以及突變型引物，正、反向引物分別引入限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和HindⅢ識別位點。當相應(yīng)的正、反義鏈擴增退火完成后，將其連接到含有熒光素酶報告基因的載體質(zhì)粒上。細胞轉(zhuǎn)染后，收集CNE-2，將含有熒光素酶報告基因的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞中。使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。實驗獨立重復3次，取均值。

2結(jié)果

2.1克隆形成實驗結(jié)果0Gy放療劑量時，CNE-2與CNE-2R的PE、細胞存活率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；3Gy、6Gy放療劑量時，CNE-2R的PE、細胞存活率高于CNE-2，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2細胞增殖活性比較照射1～5d時，CNE-2R的細胞增殖活性高于CNE-2，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3miR-150、GSK3βmRNA水平比較CNE-2R中miR-150水平高于CNE-2，GSK3βmRNA水平低于CNE-2，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

2.4GSK3β水平比較CNE-2R中GSK3β水平為(0.58±0.04)，低于CNE-2的(1.12±0.13)，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.65，P<0.001)。

2.5熒光素酶活性比較轉(zhuǎn)染GSK3β野生型質(zhì)粒后，miR-150模擬物組熒光素酶活性低于miRs無關(guān)序列組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染GSK3β突變型質(zhì)粒后，miRs無關(guān)序列組與miR-150模擬物組熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表4)。

表1　CNE-2與CNE-2R的PE及細胞存活率比較

注：PE=克隆形成率

表2　CNE-2與CNE-2R的細胞增殖活性比較

表3CNE-2與CNE-2R中miR-150、GSK3β mRNA水平比較

Table 3Comparison of the levels of miR-150 and GSK3β mRNA between CNE-2 and CNE-2R cells

細胞株miR-150GSK3βmRNACNE-20.99±0.041.00±0.07CNE-2R2.02±0.200.57±0.08t值8.176.53P值0.0010.002

注：miR-150=微小RNA-150，GSK3β=糖原合成酶激酶3β

Table 4Comparison of the luciferase activity of CNE-2 cells between miRs irrelevant sequence group and miR-150 mimics group

組別GSK3β野生型質(zhì)粒GSK3β突變型質(zhì)粒miRs無關(guān)序列組1.04±0.071.01±0.02miR-150模擬物組0.50±0.040.99±0.04t值11.991.37P值<0.0010.324

3討論

腫瘤的化療抵抗和放療抵抗是癌癥臨床治療中的主要障礙。盡管已經(jīng)建立了一些腫瘤化療或放療抵抗的細胞模型，如耐平陽霉素的舌癌Tca8113細胞株[10]、耐氟尿嘧啶的乳腺癌MCF-7細胞株[11]以及耐放療膠質(zhì)瘤MGR2細胞株[12]，并且進行了大量的機制研究，但仍然存在許多尚待進一步探討的問題。近年來，越來越多的研究表明，miRs的異常表達在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及放/化療抵抗中起重要作用，可作為癌癥重要的潛在的預(yù)后指標或治療靶點，如miR-200b的表達水平在耐多西他賽的非小細胞肺癌細胞中顯著下降[13]，其亦可通過調(diào)節(jié)膀胱癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程從而逆轉(zhuǎn)膀胱癌細胞對表皮生長因子受體的治療抵抗[14]。且近期研究發(fā)現(xiàn)，通過在順鉑耐藥舌癌細胞中重新過表達miR-200b和miR-15b，能夠減少組蛋白表達水平，使該細胞對化療重新敏感[15]。放療抵抗是鼻咽癌治療成功與否的關(guān)鍵，然而關(guān)于miRs在鼻咽癌細胞放療抵抗中的作用仍不清楚。

為了探究鼻咽癌細胞放療抵抗機制，本研究建立了放療抵抗的鼻咽癌細胞株CNE-2R，結(jié)果顯示，3 Gy、6 Gy放療劑量時，CNE-2R的PE、細胞存活率高于CNE-2；照射1～5 d時，CNE-2R的細胞增殖活性高于CNE-2。提示放療抵抗的鼻咽癌細胞株CNE-2R可以耐放療且可促進細胞的增殖。已有文獻報道，miR-150促進一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其通過靶向胃癌組織中早期生長反應(yīng)蛋白2發(fā)揮促癌作用[16]，在惡性腫瘤中可靶向促凋亡的嘌呤能P2X7受體發(fā)揮癌基因作用[17]。Ma等[18]研究發(fā)現(xiàn)，抑制GSK3β活性與EZH2過表達和腫瘤的侵襲性增加有關(guān)。研究表明，GSK3β活性對鼻咽癌生物學特性有明顯的調(diào)節(jié)作用，然而其在鼻咽癌組織中的表達仍不清楚[18]。miRs是通過調(diào)控其下游的靶基因發(fā)揮作用的，為探討miR-150和GSK3β在放療抵抗的鼻咽癌細胞株CNE-2R的表達改變和作用，本研究進一步檢測發(fā)現(xiàn)，CNE-2R中miR-150水平高于CNE-2，GSK3β mRNA及其蛋白水平低于CNE-2；轉(zhuǎn)染GSK3β野生型質(zhì)粒后，miR-150模擬物組熒光素酶活性低于miRs無關(guān)序列組，說明GSK3β是miR-150的靶基因，提示miR-150可通過靶向抑制GSK3β的表達來調(diào)控鼻咽癌細胞的放療抵抗。

本研究存在一定的局限性：(1)本研究僅比較了CNE-2與CNE-2R兩種細胞株之間的miR-150表達差異，并未涉及更多的鼻咽癌放療抵抗的細胞系；(2)未檢測人鼻咽癌組織標本中miR-150的表達。在之后的研究中，將進一步探討GSK3β對鼻咽癌細胞放療抵抗調(diào)節(jié)的詳細機制。

總之，miR-150參與了鼻咽癌細胞的放療抵抗，GSK3β是miR-150的直接靶基因，miR-150-GSK3β軸可能成為一種新的用于合理治療鼻咽癌的策略。

作者貢獻：張先鋒、黃遠見、肖娟、張志偉、黃衛(wèi)國進行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；張先鋒、黃遠見、肖娟進行實驗實施、評估、資料收集；張志偉進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Influence of miR-150 on the Radioresistance of Nasopharyngeal Carcinoma Cells

ZHANGXian-feng,HUANGYuan-jian,XIAOJuan,etal.DepartmentofOtorhinolaryngology,theSecondHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of miR-150 on the radioresistance of nasopharyngeal carcinoma(NPC) cells and analyze its mechanism.MethodsFrom January 2014 to June 2015,we established a radioresistant NPC cell line CNE-2R.CNE-2 and CNE-2R were taken,and clone formation assay was conducted to calculate cloning formation efficiency(PE) and cell survival rate with different radiotherapy doses(0,3 and 6 Gy).MTS method was employed to detect cell proliferation activity on day 1,day 2,day 3,day 4 and day 5.Real-time PCR method was used to detect the levels of miR-150 and GSK3β mRNA,and GSK3β level was measured by Western blotting method.CNE-2 cells were randomly divided into miR-150 mimics group(transfection of miR-150 mimics) and miRs irrelevant sequence group(transfection of miRs irrelevant sequence),and luciferase activity was detected by luciferasereport carrier experiment.ResultsCNE-2 and CNE-2R were not significantly different in PE and cell survival rate when the radiation dose was 0 Gy(P>0.05).CNE-2R was higher than CNE-2 in PE and cell survival rate when the radiation doses were 3 Gy and 6 Gy(P<0.05).After radiation for 1 day to 5 days,the activity of CNE-2R cell proliferation activity was higher than CNE-2(P<0.05).CNE-2R was higher in miR-150 and lower in GSK3β mRNA than CNE-2(P<0.05).CNE-2R was lower than CNE-2 in the level of GSK3β(P<0.05).After the transfection of GSK3β wild type plasmid,miR-150 mimics group was lower than miRs irrelevant sequence group in luciferase activity(P<0.05);after the transfection of GSK3β mutant plasmid,miRs irrelevant sequence group and miR-150 mimics group were not significantly different in luciferase activity(P>0.05).ConclusionmiR-150 is involved in the radioresistance of NPC cells.GSK3β is a direct target gene of miR-150,and miR-150-GSK3β axis may be a possible strategy for rational NPC treatment.

【Key words】Nasopharyngeal neoplasms;Radiotherapy;miR-150;Glycogen synthase kinases

(收稿日期：2015-08-28；修回日期：2016-02-29)

【中圖分類號】R 766.3

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.12.014

通信作者：黃衛(wèi)國，421001 湖南省衡陽市，南華大學附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，南華大學腫瘤研究所；

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81172210)；湖南省省級科技計劃項目(2014SK3081)

E-mail：nhdxzzw@qq.com