劉丹丹葛　昆孫　靜張少瀚張金超＊,(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省化學(xué)生物學(xué)重點實驗室，保定　0700)(河北大學(xué)藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點實驗室，保定　0700) (河北大學(xué)附屬醫(yī)院B超室，保定　07000)

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稀土化合物TbCl3對成骨細胞系MC3T3-E1增殖、分化和礦化功能的影響

劉丹丹1,2葛昆1孫靜3張少瀚1張金超＊,1,2
(1河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省化學(xué)生物學(xué)重點實驗室，保定071002)
(2河北大學(xué)藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點實驗室，保定071002) (3河北大學(xué)附屬醫(yī)院B超室，保定071000)

摘要：在細胞和分子水平上，研究了稀土化合物氯化鋱(TbCl3)對成骨細胞MC3T3-E1增殖、分化及礦化功能的影響。結(jié)果表明，細胞水平上，濃度為0.000 1、0.001、0.01、0.1、1和10 μmol·L(-1)的TbCl3均促進MC3T3-E1細胞的增殖、分化及其礦化功能，然而，當(dāng)濃度升至為100和1 000 μmol·L(-1)時，TbCl3表現(xiàn)出抑制作用。分子水平上，濃度為0.000 1和0.1 μmol·L(-1)的TbCl3明顯上調(diào)成骨分化相關(guān)基因骨形成蛋白2(BMP-2)，堿性磷酸酶(ALP)，骨涎蛋白(BSP)，Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)，骨鈣素(OCN)和runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的表達。濃度為1 000 μmol·L(-1)的TbCl3則抑制上述成骨分化相關(guān)基因的表達。濃度為0.000 1、0.1和1 μmol·L(-1)的TbCl3促進成骨分化相關(guān)蛋白Runx2，BMP-2和OCN的表達；結(jié)果顯示，低濃度的TbCl3促進MC3T3-E1細胞的成骨分化及礦化功能，而高濃度TbCl3則呈現(xiàn)出抑制作用。TbCl3通過調(diào)控Runx2的表達刺激早期成骨分化相關(guān)基因BMP-2、ColⅠ和晚期成骨分化相關(guān)基因ALP、OCN的表達，從而誘導(dǎo)MC3T3-E1成骨分化。

關(guān)鍵詞：三氯化鋱；增殖；成骨分化；礦化

國家自然科學(xué)基金(No.20971034和21271059)資助項目。＊通信聯(lián)系人。E-mail：jczhang6970@163.com

0引　言

稀土元素鋱(Tb)已廣泛應(yīng)用于工業(yè)，例如，摻Tb的法拉第磁光玻璃、光纖通信、傳感器等。除此之外，Tb化合物在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用也甚為廣泛。Ye等[1]報道，Tb摻雜的二氧化硅納米顆粒作為熒光探針廣泛應(yīng)用于高靈敏臨床分析、時間分辯熒光成像技術(shù)及其它生物技術(shù)上。Hussein等[2]發(fā)現(xiàn)三價Tb化合物具有較強的抗腫瘤活性，可以抑制人肝癌細胞HepG2和人乳腺癌細胞MCF7的生長。另外，Kubícˇek等[3]發(fā)現(xiàn)，三價Tb化合物作為骨靶向造影劑對羥基磷灰石有一定的吸收能力，從而影響骨礦化能力。隨著稀土Tb的廣泛應(yīng)用，其在人體內(nèi)的蓄積和分布已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。據(jù)文獻報道[4-5]，稀土一般在動物、人的肝、脾、骨等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)組織積聚較多，輕稀土主要蓄積在肝臟；重稀土則主要沉積于骨骼，如靜脈注射Tb，有80%存在于兔子的骨骼中?？紤]到稀土Tb3+和Ca2+具有相似的生化行為，然而到目前為止，Tb是否以及如何干預(yù)骨代謝卻不是很清楚。

小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1具有較好的分化及礦化能力，可以作為體外研究成骨細胞增殖、分化、礦化及調(diào)控機理的良好模型[6]。為了確證稀土化合物TbCl3是否以及如何影響成骨細胞的增殖和分化，本文從細胞和分子水平上研究了不同濃度的TbCl3對體外培養(yǎng)的成骨細胞的增殖、分化、礦化功能等的影響。結(jié)果顯示，低濃度的TbCl3在細胞水平上均促進MC3T3-E1細胞的增殖、分化及其礦化功能，而高濃度則呈現(xiàn)出了抑制性。分子水平上，濃度為0.000 1和0.1 μmol·L-1的TbCl3上調(diào)了成骨分化相關(guān)基因Runx2、BMP-2、ALP和OCN和蛋白的表達。

1　實驗部分

1.1材料和試劑

成骨細胞系MC3T3-E1購于ATCC(Manassas, VA，USA)。α-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco。氯化鋱(TbCl3)、青鏈霉素、MTT、β-甘油磷酸鈉、胰蛋白酶、地塞米松、抗壞血酸、胰島素、西吡氯銨和茜素紅購自Sigma。細胞堿性磷酸酶測定試劑盒和蛋白含量測定試劑盒分別從南京建成生物工程研究所和碧云天生物技術(shù)公司購買。細胞裂解液Trizol和RNA純化試劑盒購自Life Technologies。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa。成骨分化相關(guān)基因引物序列及抗體分別購自生工生物工程(上海)股份有限公司和Santa Cruz Biotechnology。

1.2成骨細胞系MC3T3-E1的培養(yǎng)

小鼠成骨細胞系MC3T3-E1用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2的孵育箱(Sanyo，Model MCO-18AIC)內(nèi)培養(yǎng)，每隔3 d更換培養(yǎng)基。待細胞80%匯合后，用0.25%胰蛋白酶加0.02%的乙二胺四乙酸(EDTA)消化傳代。

1.3細胞增殖的測定

根據(jù)MTT法[7]，MC3T3-E1細胞以每孔2 000個接種于96孔板，于37℃，5% CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后，加入不同濃度的TbCl3，使其終濃度達到0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100和1 000 μmol·L-1。細胞加入10-6μmol·L-1的NaF作為陽性對照，不含細胞孔設(shè)為空白，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3 d，加入20 μL濃度為5 mg·mL-1的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜(DMSO)溶解。利用酶標(biāo)儀(Bio-rad Model 680，USA)測定570 nm處的光密度OD值,根據(jù)下面公式計算增殖率：(ODsample-ODcontrast)/ODcontrast×100%。

1.4堿性磷酸酶(ALP)活性的測定

MC3T3-E1細胞以每孔2×104個的密度接種于48孔板中培養(yǎng)。待細胞貼壁后更換含有成骨誘導(dǎo)劑(OS)(10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉(β-GP)，0.15 mmol·L-1抗壞血酸和10-8mol·L-1地塞米松)的培養(yǎng)基[8]，同時，加入終濃度為3.0 mmol·L-1的NaH2PO4和不同濃度的TbCl3(0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100和1 000 μmol·L-1)。培養(yǎng)7、10、14 d后，培養(yǎng)板用冷的D-Hank′s洗2次，2次凍融裂解。用細胞堿性磷酸酶測定試劑盒和蛋白含量測定試劑盒分別測定上層清液的堿性磷酸酶活性和蛋白量，所有的結(jié)果通過蛋白的含量歸一化。

1.5礦化結(jié)節(jié)染色及定量測定

MC3T3-E1細胞(每孔2×104個)接種于24孔板中，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。細胞貼壁后加入礦化誘導(dǎo)劑(10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉和50 mg·L-1抗壞血酸)和終濃度為0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100和1 000 μmol·L-1的TbCl3，繼續(xù)培養(yǎng)21 d，采用茜素紅(ARS)對礦化結(jié)節(jié)染色。首先用D-Hank′s洗2次，然后用70%乙醇室溫固定1 h，加入10% ARS(pH 4.2)，于37℃孵育30 min，隨后吸去染液，用D-Hank′s洗2次。加入10%西吡氯銨溶液，室溫放置10 min，于570 nm測定光密度OD值。實驗結(jié)果以礦化促進率(100%)表示。

1.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

濃度為0.000 1、0.1和1 000 μmol·L-1的TbCl3作用于細胞4 d后，用Trizol裂解細胞，提取總RNA。根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法轉(zhuǎn)第一鏈cDNA。實時定量PCR擴增為40個循環(huán)，條件為：于95℃變性10 min，60℃退火1 min，72℃延伸30 s。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。表1為引物序列。

表1　成骨分化相關(guān)基因引物序列Table1　Osteogenesis-related genes primers

1.7蛋白印記分析

濃度為0.000 1、0.1和1 μmol·L-1的TbCl3作用于細胞4 d后，收集細胞并在細胞裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl、10 mmol·L-1EDTA、4.3 M尿素和1% Triton X-100)中進行裂解。通過10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，轉(zhuǎn)膜、封閉后于4℃一抗雜交過夜，之后二抗雜交2 h。特異性雜交反應(yīng)利用化學(xué)發(fā)光通過蛋白成像儀LAS-1000(Fuji-Film)進行成像。細胞內(nèi)β-actin的表達作為內(nèi)參。

1.8統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)來自至少3次獨立的實驗，數(shù)據(jù)表示為：平均值±標(biāo)準偏差。數(shù)據(jù)分析采用SPSS ttest，P<0.05認為有顯著性差異。

2　結(jié)果與討論

2.1 TbCl3對MC3T3-E1細胞增殖的影響

如圖1所示，濃度為0.000 1、0.001、0.01、0.1 和1 μmol·L-1的TbCl3作用于MC3T3-E1細胞1、2、3 d后促進其增殖。然而濃度為100和1 000μmol·L-1的TbCl3則抑制MC3T3-E1細胞的增殖。濃度為10 μmol·L-1的TbCl3作用MC3T3-E1細胞1、2 d后抑制細胞增殖，而作用3 d后則表現(xiàn)為促進作用。總之，TbCl3對細胞增殖的影響呈現(xiàn)出低劑量促進、高劑量抑制的關(guān)系。

圖1　稀土化合物TbCl3對MC3T3-E1細胞增殖的影響Fig.1 Effect of TbCl3on the proliferation of MC3T3-E1

2.2 TbCl3對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響

如圖2所示，TbCl3作用于MC3T3-E1細胞7、14 d后，濃度為0.000 1、0.001、0.01、0.1、1和10 μmol·L-1的TbCl3促進了細胞的成骨分化，且呈現(xiàn)出時間依賴的關(guān)系。而高濃度的TbCl3(100 和1 000 μmol·L-1)則抑制細胞的成骨分化。

圖2　TbCl3對MC3T3-E1細胞分化的影響Fig.2　 Effect of TbCl3on the diffenentiation of MC3T3-E1

2.3 TbCl3對礦化結(jié)節(jié)形成的影響

與對照組比較，低濃度(0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol·L-1)的TbCl3促進礦化結(jié)節(jié)的形成，然而濃度為100、1 000 μmol·L-1的TbCl3抑制了礦化結(jié)節(jié)的形成，呈現(xiàn)出了劑量依賴關(guān)系。定量結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察(圖3a～d)也是一致的。

圖3　TbCl3對MC3T3-E1細胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響Fig.3 Effect of TbCl3on the mineration of MC3T3-E1

2.4 TbCl3對MC3T3-E1細胞成骨分化基因表達的影響

如圖4所示，濃度為0.000 1和0.1 μmol·L-1的TbCl3作用MC3T3-E1細胞4 d后，與對照組比較，明顯上調(diào)了成骨分化相關(guān)基因BMP-2、ALP、BSP、ColⅠ、OCN和Runx2的表達。特別是BMP-2、ALP、ColⅠ、OCN和Runx2基因表達量高于陽性對照組NaF。但是當(dāng)濃度為1 000 μmol·L-1的TbCl3作用于細胞4 d后，則抑制了成骨分化相關(guān)基因的表達。

圖4　TbCl3對成骨分化相關(guān)基因表達的影響Fig.4 Effect of TbCl3on the expression of osteogenesisrelated genes in MC3T3-E1

2.5 TbCl3對MC3T3-E1細胞成骨分化蛋白表達的影響

蛋白印記結(jié)果(圖5)顯示，與對照組比較，MC3T3-E1細胞經(jīng)過TbCl3(濃度為0.000 1、0.1和1 μmol·L-1)作用4 d后，成骨分化相關(guān)蛋白Runx2，BMP-2和OCN的表達明顯上調(diào)。特別是濃度為0.000 1 μmol·L-1的TbCl3促進蛋白表達量遠高于NaF陽性對照。

圖5　TbCl3對成骨相關(guān)蛋白表達影響Fig.5　 Effect of TbCl3on the expression of the osteogenesis-related proteins in MC3T3-E1

2.6 TbCl3促進MC3T3-E1細胞增殖、分化及礦化功能

成骨細胞是負責(zé)骨形成，對骨組織的生長發(fā)育、損傷修復(fù)、維持骨代謝平衡和骨量的一類細胞。成骨分化分為3個步驟：細胞增殖、細胞外基質(zhì)合成及礦化結(jié)節(jié)的形成。小鼠成骨細胞系MC3T3-E1具有極好的成骨分化潛能，血清和抗壞血酸即可刺激其向骨細胞分化[6]。因此，MC3T3-E1細胞系提供了一個體外研究骨細胞增殖和礦化的細胞模型。細胞通過一系列復(fù)雜的信號通路維持其代謝平衡。然而，一旦這些信號通路被擾亂，細胞將會面臨功能的缺失和行為異常[9]。ALP活性是成骨分化的一個早期標(biāo)志，由此開始骨的形成。礦化結(jié)節(jié)的形成是成骨分化的晚期標(biāo)志，成骨細胞誘導(dǎo)2～3周后，分化成的骨細胞結(jié)節(jié)形成并且達到最大量。本文研究發(fā)現(xiàn)，TbCl3對成骨細胞MC3T3-E1增殖、分化及礦化功能具有雙重作用，表現(xiàn)為低濃度(0.000 1、0.001、0.01、0.1、1和10 μmol·L-1)促進、高濃度(100和1 000 μmol·L-1)抑制。低濃度的稀土離子促進細胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細胞DNA合成，從而促進細胞增殖；但是當(dāng)稀土濃度增加到一定程度時對細胞表現(xiàn)出損傷作用，從而轉(zhuǎn)為抑制成骨細胞的增殖。作者曾報道稀土La和Ce對MC3T3-E1和骨髓間充質(zhì)細胞介導(dǎo)的上述過程的許多環(huán)節(jié)都造成影響，且呈現(xiàn)出低濃度促進、高濃度抑制的作用關(guān)系[10-13]。由此看來，稀土的濃度在抑制或促進成骨細胞增殖和分化過程中起到關(guān)鍵作用。Quarles 等[14]發(fā)現(xiàn)，低劑量Gd3+離子能夠促使成骨細胞MC3T3-E1從G1進入S期和促進DNA合成，同時激活成骨細胞膜上的G蛋白，從而促進了細胞的增殖。結(jié)合La和Ce的結(jié)果，作者推測，稀土離子Ln3+對體外成骨細胞的增殖、分化和功能表達與稀土物種有關(guān)。另外，劉會雪等[15]報道，不同稀土離子對細胞作用強弱不同，再次證明稀土物種對細胞功能影響的重要性。除此之外，由于稀土理化特性的差異(如離子半徑或電荷)，其對成骨細胞增殖、分化及礦化影響也不同。

細胞通過復(fù)雜的信號通路維持其內(nèi)在平衡，任何擾亂信號通路的行為將影響細胞功能及行為正常發(fā)揮[9]。復(fù)雜的信號通路必然涉及到大量的基因和蛋白的表達，如成骨細胞分化涉及到BMP-2、Runx2、ALP、OCN、ColⅠ、BSP等表達[16]。Runx2是調(diào)控成骨分化的關(guān)鍵因子，它的表達是成骨分化的一個重要標(biāo)志。文獻報道Runx2基因敲除的小鼠不能建立骨組織或不能分化出骨細胞，且過多表達了與Runx2作用相反的一些基因，因此導(dǎo)致成骨分化失敗[17]。正常表達Runx-2基因的細胞具有與原代骨細胞同樣的特性，如在抗壞血酸誘導(dǎo)下能夠合成細胞外基質(zhì)(ECM)和在不同階段表達與成骨分化相關(guān)的基因[18]。ALP負責(zé)去除細胞內(nèi)的磷酸根，如核酸、蛋白和生物堿等，在骨組織(如骨及軟骨)礦化形成過程中起到了關(guān)鍵的作用[19]。OCN是骨細胞外基質(zhì)中最為豐富的非膠原成分，其表達始于增殖后期，在礦化形成期達到最高。它的表達量決定了ECM礦化的程度[20]，而礦化又是骨細胞分化的一個標(biāo)志。另外，骨涎蛋白(BSP)和ColⅠ是ECM的重要組成物質(zhì)。BMP-2作為TGF-β超家族一元，是骨細胞分化和骨形成過程中所必須的一種蛋白，即使對于不能進行礦化的骨細胞，它也能夠誘導(dǎo)低表達的骨標(biāo)志基因(如OCN和ALP)表達上調(diào)[21]。本文結(jié)果表明，濃度為0.000 1和0.1 μmol·L-1的TbCl3上調(diào)了BMP-2、ALP、BSP、ColⅠ、OCN和Runx2的表達。然而，當(dāng)濃度為1 000 μmol·L-1的TbCl3作用于細胞4 d后，抑制了成骨分化相關(guān)基因的表達。表達上調(diào)的Runx2基因誘導(dǎo)成骨分化早期標(biāo)志基因ColⅠ和BMP-2和晚期標(biāo)志基因ALP和OCN的表達，從而促進MC3T3-E1細胞成骨分化及礦化形成。結(jié)合茜素紅染色的結(jié)果，高度表達的OCN刺激了MC3T3-E1細胞礦化結(jié)節(jié)的形成。稀土低濃度促進細胞增殖、分化和礦化的機理尚未完全清楚，根據(jù)文獻報道和我們的結(jié)果推斷，可能與低濃度稀土促進細胞有絲分裂有關(guān)，從而刺激一系列分化通路的激活，誘導(dǎo)其成骨分化；然而，稀土離子濃度達到一定高的濃度后，反而抑制細胞正常功能，造成成骨細胞分化及礦化功能受阻。綜上所述，一定濃度的稀土TbCl3對體外培養(yǎng)的成骨細胞的增殖、分化都具有明顯的促進作用，從而在低濃度下可以促進成骨細胞誘導(dǎo)的鈣化，促進骨形成。此研究將為進一步探討稀土化合物TbCl3調(diào)控骨代謝平衡機理提供了重要的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

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Effects of TbCl3on the Proliferation, Osteogenic Differentiation and Mineralization Function of MC3T3-E1 Cells in Vitro

LIU Dan-Dan1,2GE Kun1SUN Jing3ZHANG Shao-Han1ZHANG Jin-Chao＊,1,2
(1College of Chemistry and Environmental Science, Chemical Biology Key Laboratory of Hebei Province, Hebei University, Baoding, Hebei 071002, China)
(2Key Laboratory of Medicinal Chemistry and Molecular Diagnosis of the Ministry of Education, Hebei University, Baoding, Hebei 071002, China)
(3B-Ultrasound Room, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding, Hebei 071000, China)

Abstract:The effects of TbCl3on the proliferation, differentiation, and mineralization of a murine preosteoblast cell line MC3T3-E1 at cell and molecule levels were investigated in vitro. The results showed that TbCl3with concentrations of 0.000 1, 0.001, 0.01, 0.1, 1, and 10 μmol·L(-1)promoted the proliferation, differentiation, and mineralization of MC3T3-E1 cells, while the TbCl3with the concentrations of 100 and 1 000 μmol·L(-1)showed the contrary effects. On the molecular level, the expressions of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), alkaline phosphatase (ALP), bone sialopmtein (BSP), Collagen TypeⅠ(ColⅠ), osteocalcin (OCN), and runt-related transcription factor 2 (Runx2) genes were up-regulated by 0.000 1 andbook=584,ebook=330.1 μmol·L(-1)TbCl3treatments through the reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), but TbCl3with the concentration of 1 000 μmol·L(-1)down-regulated the expressions above osteogenic differentiation related genes. The expressions of Runx2, BMP-2, and OCN proteins were up-regulated by 0.000 1, 0.1 and 1 μmol·L(-1)TbCl3treatments. The results suggested that TbCl3with lower concentrations promoted, but higher concentrations inhibited the proliferation, osteogenic differentiation, and mineralization of MC3T3-E1 cells. TbCl3likely regulated the expression of Runx2, which subsequently stimulated osteoblasts marker genes BMP-2 and ColⅠat early stages and ALP and OCN at later stages of differentiation, thus promoted the proliferation, osteogenic differentiation and mineralization of MC3T3-E1 cells.

Keywords:TbCl3; proliferation; osteogenic differentiation; mineralization

收稿日期：2015-10-10。收修改稿日期：2015-12-04。

DOI：10.11862/CJIC.2016.072

中圖分類號：TQ462+91

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-4861(2016)04-0583-06