岑延利， 楊光紅*， 桂曉玲， 張愛(ài)華， 李傳美

(貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng)　550025)

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飲用水有機(jī)提取物對(duì)L02細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響*

岑延利**， 楊光紅***， 桂曉玲， 張愛(ài)華， 李傳美

(貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng)550025)

[摘要]目的： 探討飲用水有機(jī)提取物對(duì)人正常肝細(xì)胞(L02)的細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。方法： 體外培養(yǎng)L02細(xì)胞，將其分別暴露于培養(yǎng)液(空白對(duì)照組)、0.1% DMSO(溶劑對(duì)照組)和0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 L/mL固相萃取法提取的飲用水有機(jī)提取物(染毒組)中24、48及72 h, 采用MTT法觀察L02細(xì)胞的增殖情況, 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的構(gòu)成比。結(jié)果： (1)與溶劑對(duì)照組比較，各染毒組細(xì)胞活力隨著有機(jī)提取物濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(2)隨染毒劑量的增加，細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞比例逐漸下降，除24 h、48 h 0.312 5 L/mL染毒組外，其余劑量染毒組G0/G1期細(xì)胞比例均明顯低于溶劑對(duì)照組(P<0.05)；S期細(xì)胞比例則隨有機(jī)提取物濃度的增加而上升，除24、48及72 h 0.312 5 L/mL的染毒組外，其余染毒組中S期細(xì)胞比例的增加與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；染毒48 h、72 h后，L02細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例低于24 h染毒組(P<0.05)；S期細(xì)胞比例則高于24 h染毒組(P<0.05)。結(jié)論： 在本研究條件下，飲用水有機(jī)提取物可以阻滯L02細(xì)胞于S期，抑制細(xì)胞的增殖，且呈時(shí)間、劑量依賴性。

[關(guān)鍵詞]飲用水； 有機(jī)提取物； 肝細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞周期

飲用水源中一般都含有一定濃度的天然有機(jī)物，工業(yè)廢水及城鎮(zhèn)生活污水[1]、廢氣和廢渣大量排放到自然水環(huán)境中，加之農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥的大量使用，也會(huì)對(duì)水體造成了嚴(yán)重污染，影響飲水安全[2]。研究發(fā)現(xiàn)，水源有機(jī)物污染對(duì)人體有致畸、致癌、致突變、生殖毒性及細(xì)胞毒性等危害[3-5]。課題組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)仫嬘盟袡C(jī)提取物可誘導(dǎo)雄性大鼠精子畸形、雄性激素分泌水平異常，同時(shí)可導(dǎo)致染色體斷裂、肝臟DNA損傷等[6-9]。本研究萃取G市某地飲用水的有機(jī)污染物，對(duì)人正常肝細(xì)胞系L02細(xì)胞進(jìn)行染毒，觀察有機(jī)提取物對(duì)L02肝細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、主要試劑及儀器

正常人肝L02細(xì)胞，來(lái)源于中科院昆明細(xì)胞庫(kù)。MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Solarbio 公司)，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，XAD-2大孔樹(shù)脂(20-60目，美國(guó)Sigma公司)，70%乙醇、甲醇、二氯甲烷(川東化工)，胰蛋白酶(Beyotime 公司)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-3000，上海亞英生化儀器有限公司)，超級(jí)酶標(biāo)儀(Max200， 美國(guó)Bio-Tek公司 )，流式細(xì)胞儀(FC500，貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)有限公司)。

1.2方法

1.2.1水樣采集與有機(jī)物提取采集G市某地管網(wǎng)末梢水，采用固相萃取法[10]富集水中有機(jī)物，萃取劑為XAD-2樹(shù)脂，洗脫劑為二氯甲烷和甲醇，水樣過(guò)柱流速為4倍柱體積/min，過(guò)柱完后依次用3倍柱體積的二氧甲烷和甲醇先后洗柱，流速0.1倍柱體積/min，洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀25 ℃減壓蒸餾揮干，將已揮干的濃縮提取物用DMSO定容，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2L02細(xì)胞培養(yǎng)及染毒劑量確定細(xì)胞培養(yǎng)基采用含10%胎牛血清的DMEM，并加入青霉素和鏈霉素，使其終濃度分別為100 U/mL和100 mg/L。將人肝L02細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化液消化細(xì)胞并傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)[11]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最高染毒劑量為5.000 0 L/mL，向下以2倍組距另設(shè)4個(gè)染毒劑量組，分別為2.500 0 L/mL、1.250 0 L/mL、0.625 0 L/mL和0.312 5 L/mL，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組(0.1%DMSO)和空白對(duì)照組(培養(yǎng)液)，處理時(shí)點(diǎn)為24 、48及72 h。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，從培養(yǎng)瓶(25 cm2)中移去舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液輕柔漂洗2～3次，加入0.25%的胰蛋白酶1 mL消化，棄消化液后用新鮮培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)24 h。每孔加入染毒培養(yǎng)基100 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，處理時(shí)點(diǎn)為24 h、48 h和72 h。細(xì)胞染毒結(jié)束后小心吸掉上清液，每孔中加入MTT溶液50 μL (5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL， 室溫下平板搖床上搖晃10 min，測(cè)定光密度D(490 nm)值，并計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組D/對(duì)照組D×100。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期細(xì)胞染毒結(jié)束后，收集各組細(xì)胞懸液，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，用4 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定2 h，PBS再洗滌3次，加入RNase至終濃度50 mg/L及碘化丙碇(PI)染液至終濃度50 mg/L，37 ℃孵育30 min后，用FC500 型流式細(xì)胞儀在 488 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè) DNA 含量，分析細(xì)胞在增殖周期中 G 1期、 G 2 期和 S 期的分布。重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞周期各時(shí)相的百分比。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1L02細(xì)胞增殖活力

隨染毒劑量的增加，L02細(xì)胞增殖活力逐漸降低，各染毒組與溶劑對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨染毒時(shí)間延長(zhǎng)，L02細(xì)胞增殖活力亦逐漸下降，48及72 h染毒組均明顯低于24 h染毒組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2L02細(xì)胞細(xì)胞周期

除24和48 h的0.312 5 L/mL染毒組外，其余染毒組L02細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例均隨染毒劑量的增加而明顯降低 (P<0.05)；除24、48 及72 h的0.312 5 L/mL染毒組外，其余染毒組L02細(xì)胞中S期細(xì)胞比例均隨染毒劑量的增加而明顯升高 (P<0.05)。48 和72 h染毒組，L02細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例均明顯低于24 h染毒組(P<0.05)，而S期細(xì)胞比例則明顯高于24 h染毒組(P<0.05)。見(jiàn)表2、3、4。

表1　飲用水有機(jī)提取物染毒對(duì)L02細(xì)胞

(1)與同時(shí)點(diǎn)溶劑對(duì)照組比較，P<0.05

圖1　飲用水有機(jī)提取物對(duì)L02細(xì)胞增殖活力的影響Fig.1　Influence of organic extracts from drinking water on L02 cell proliferation

組別L02細(xì)胞周期(%)G0/G1SG2/M空白對(duì)照組 90.92±1.45 9.04±1.380.11±0.10溶劑對(duì)照組 89.75±1.1210.15±1.030.10±0.10有機(jī)提取物 0.3125L/mL組84.88±0.0912.38±0.012.74±0.08(1) 0.6250L/mL組83.93±0.77(1)15.66±0.64(1)0.40±0.26(1) 1.2500L/mL組79.46±0.20(1)19.36±0.20(1)1.19±0.04(1) 2.5000L/mL組77.41±1.70(1)20.02±0.55(1)3.57±0.52(1) 5.0000L/mL組74.51±0.15(1)20.75±1.43(1)4.75±1.51(1)

(1)與同細(xì)胞周期溶劑對(duì)照組比較，P<0.05

表3　飲用水有機(jī)提取物染毒48 h時(shí)

(1)與同細(xì)胞周期溶劑對(duì)照組比較，P<0.05

表4　飲用水有機(jī)提取物染毒72 h

(1)與溶劑對(duì)照組比較，P<0.05

3討論

圖2　飲用水有機(jī)提取物不同時(shí)間染毒對(duì)L02細(xì)胞周期變化的影響Fig.2　Changes of L02 cells cycle caused by organic extracts from drinking water during different time

生命體的重要特征是細(xì)胞通過(guò)分裂來(lái)增殖、分化，使個(gè)體發(fā)育、成熟并繁衍后代。由于MTT比色法可間接反映活細(xì)胞的多少，且使用酶標(biāo)儀操作簡(jiǎn)便、快速。因此，本研究采用MTT比色法檢測(cè)飲用水有機(jī)提取物對(duì)人肝L02細(xì)胞體外增殖的影響, 發(fā)現(xiàn)不同濃度飲用水有機(jī)提取物處理人肝L02細(xì)胞24、48及72 h后， 各染毒劑量均能顯著降低其增殖水平；從量效關(guān)系來(lái)看，各個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)L02細(xì)胞活力均隨染毒劑量的增大而降低，具有劑量依賴性(P<0.05)。從時(shí)效關(guān)系看，有機(jī)提取物染毒48和72 h時(shí)L02細(xì)胞活力與染毒24 h時(shí)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 該地飲用水有機(jī)提取物染毒濃度為0.312 5 L/mL,染毒時(shí)間為24 h時(shí)，即可抑制L02細(xì)胞的增殖。細(xì)胞增殖的抑制通常與細(xì)胞周期異常有關(guān)。一個(gè)細(xì)胞周期分為2個(gè)階段：分裂期和間期。分裂期是物質(zhì)準(zhǔn)備和積累階段，包括：G1期、S期及G2期[12-13]。趙淑華等[14]的研究顯示某地飲用水有機(jī)提取物染毒后，HL-7702細(xì)胞的增殖受抑，且可能與S期阻滯有關(guān)。由于各地污染物構(gòu)成不同，其健康危害效應(yīng)及可能機(jī)制不盡相同。為保障本地方人群健康，本實(shí)驗(yàn)萃取飲用水有機(jī)污染物，觀察其肝細(xì)胞毒性，為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。本地飲用水有機(jī)提取物染毒L02后，處理組的細(xì)胞周期出現(xiàn)異常， G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低，S期細(xì)胞比例則顯著增加。S期是細(xì)胞周期的關(guān)鍵時(shí)點(diǎn)，DNA經(jīng)過(guò)復(fù)制后，含量增加一倍，可順利進(jìn)入G2期。而本研究中，該地飲用水有機(jī)污染物可阻滯細(xì)胞周期于S期，從而影響了人肝L02細(xì)胞的DNA合成，使其不能順利進(jìn)入M期，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞周期延長(zhǎng)，不能正常分裂，從而抑制細(xì)胞增殖。目前，細(xì)胞周期調(diào)控的核心分子基礎(chǔ)是Cyclin、CDK和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)[15]。本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞周期的阻滯、細(xì)胞增殖受抑是否與此有關(guān)，有待于進(jìn)一步深入研究。

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(2015-12-22收稿，2016-02-23修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 趙毅

The Influence on Cell Proliferation and Cell Cycle of L02 Cells Exposed to Organic Extracts from Drinking Water

CEN Yanli， YANG Guanghong， GUI Xiaoling， ZHANG Aihua， LI Chuanmei

(SchoolofPublicHealth,GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550025,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the influence of organic extracts from drinking water on liver cell (L02) proliferation and cell cycle. Methods: The L02 cells was cultivated in vitro: blank control group (culture solution), solvent control group (0.1%DMSO); organic extracts group (The dose of pollutants groups were 0.312 5, 0.625 0, 1.250 0, 2.500 0 and 5.000 0 L/mL samples were extracted by solid phase extraction method). Each group was treated for 24 h, 48 h and 72 h. Cell proliferation was measured by MTT assay. The constituent ratio of cell cycle was detected with flow cytometry. Results: (1) Compared with solvent control group, cell vitality of L02 cells decreased gradually with the increasing of exposure time and concentration of organic extracts. The differences were statistically significant (P<0.05). (2)The proportion of cells in G0/G1 phase decreased gradually with the increasing concentration of organic extracts. Except for 0.312 5 L/mL of pollutants group at 24 h and 48 h, significant differences were found in other exposure groups (P<0.05). The proportion of cell in S phase increased gradually with the increasing concentration of organic extracts. Except for 0.312 5 L/mL at 24 h, 48 h and 72 hr exposure, significant differences existed compared with solvent control group, differences were statistically significant (P<0.05). Compared with 24 h exposure group, exposed groups at 48 h-exposure and 72 h-exposure demonstrated significantly increase in G0/G1phase cell proportion and S phase cell proportion with increasing time (P<0.05). Conclusions: The results of the present paper showed that the organic extracts from drinking water can inhibit cell proliferation and change cell cycle of L02 cells.

[Key words]drinking water; organic extracts; hepatic cells; cell proliferation; cell cycle

[中圖分類號(hào)]R114

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)03-0294-04

*[基金項(xiàng)目]貴州省科技廳基金[黔科合LH字(2014)7102]； 貴陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目[筑科合同(2013103)19號(hào)]

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)碩士研究生

***通信作者 E-mail:280446859@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-17網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1029.024.html