楊　虓， 王艷輝， 蘇曉慶,3**

(1.珠海盈嘉行科技有限公司， 廣東 珠海　519000； 2.宜昌安瑞普生物科技公司， 湖北 宜昌　443000； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽　55004)

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·專題研究·

貴陽腐霉滅蚊能力持效性研究*

楊虓1， 王艷輝2， 蘇曉慶1,3**

(1.珠海盈嘉行科技有限公司， 廣東 珠海519000； 2.宜昌安瑞普生物科技公司， 湖北 宜昌443000； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽55004)

[摘要]目的： 研究貴陽腐霉滅蚊能力的持效性。方法： (1)用貴陽腐霉菌絲體連續(xù)感染2批蚊幼蟲，觀察2批蚊幼蟲的死亡率及感染率，計算感染率；(2)采用室外人工模擬法，設(shè)立對照組、貴陽腐霉組、貴陽腐霉加Bti組、貴陽腐霉加真菌D組、和貴陽腐霉加Bti和真菌D組，加入貴陽腐霉后第111天和273天分別加入2～3齡蚊幼蟲(哨位蚊)48 h后取出，觀察蚊幼蟲死亡情況及感染率；(3)于菜地蓄水池中投入貴陽腐霉菌絲體懸液，并于投入前及投入后第5、15、30、57及122天記錄蚊幼蟲數(shù)，觀察感染情況；(4)在Bti致死的蚊幼蟲中加入貴陽腐霉菌，觀察貴陽腐霉的腐生情況。結(jié)果： (1)3株貴陽腐霉的感染力有不同，但是在第2批實驗中蚊蟲的校正感染率、單碗最高感染率和單碗最低感染率均明顯高于第1批(P<0.05)；(2)在室外模擬水體實驗中，純貴陽腐霉組及其他含貴陽腐霉組第111天哨位蚊全部死亡，對照組蚊蟲無死亡；第273天僅純貴陽腐霉組的哨位蚊死亡，顯微鏡下觀察死亡蟲體均布滿貴陽腐霉菌絲；(3)菜地蓄水池實驗結(jié)果顯示，投放貴陽腐霉菌絲體第5天蚊蟲密度較投放前明顯減少，投放第15天時偶見蚊幼蟲，投放第30及57天時基本上看不見蚊幼蟲，第122天見大量死蚊，顯微鏡下觀察蚊體有真菌感染；(4)腐生實驗發(fā)現(xiàn)被Bti殺死的蚊幼蟲尸體長滿貴陽腐霉的菌絲，產(chǎn)生大量孢子囊，并釋放游動孢子。結(jié)論： 貴陽腐霉在水體中可長期制約蚊蟲, 持效期最長達(dá)273 d。

[關(guān)鍵詞]貴陽腐霉； 真菌； 生物滅蚊； 持效，長效制劑

近年來蚊媒病的流行，使蚊蟲的防治再次提上日程[1]。目前大多采用化學(xué)殺蟲劑控制蚊蟲，這不僅會導(dǎo)致環(huán)境污染，更嚴(yán)重的是還會誘導(dǎo)蚊蟲產(chǎn)生抗藥性，進(jìn)一步增加防蚊工作中人力物力的浪費(fèi)[2-5]。蚊蟲生物防治是對環(huán)境無害的一種手段，已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)之一。貴陽腐霉是一種有開發(fā)應(yīng)用前景的滅蚊真菌，自從1994年從土壤中獲得該菌以來，已對其進(jìn)行了大量的研究，包括生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性、對環(huán)境的安全性及其滅蚊能力等方面[6]。因貴陽腐霉是兼性寄生真菌，既可以營寄生生活，又可以營腐生生活，并可以在水環(huán)境中定植。那么它的這一特性是否能夠使它對蚊蟲的控制有比較長的持效期呢，本文對此進(jìn)行觀察和研究。

1材料與方法

1.1菌種和蚊蟲

研究所用貴陽腐霉為本實驗室保種，在SFE培養(yǎng)基中傳代，每月進(jìn)行一次蟲體復(fù)壯(制成含貴陽腐霉菌絲體的瓊脂塊)；所用滅蚊細(xì)菌為5日菌齡的蘇云金桿菌以色列變種(Bacillus thuringiensis var. israelensis，Bti)；所用致倦庫蚊為本實驗室馴化并培養(yǎng)的2～3日齡幼蟲，養(yǎng)蚊室溫度(25±1)℃，濕度70%，光周期L∶D=14∶10。模擬室外滅蚊實驗采用另一滅蚊真菌(代號D)與貴陽腐霉進(jìn)行對比實驗。

1.2方法

1.2.1室內(nèi)生物測定取耐高溫塑料碗8只，高壓滅菌后，每碗盛200 mL過夜自來水，加25只致倦庫蚊幼蟲、4%雞肝粉懸液8滴，均分為實驗組和對照組，實驗組加入帶菌絲的瓊脂塊(面積約為113 m2)3塊，對照組每碗加入3塊空白SFE瓊脂塊。每天觀察2次，取出死蚊，顯微鏡下觀察感染情況。記錄蚊蟲死亡數(shù)和感染數(shù)，計算總感染率和單碗感染率，感染率=(感染數(shù)/蚊蟲總只數(shù))×100%。共測試3個菌株。第1批蚊蟲死亡或化蛹后全部取出，并加入第2批蚊幼(25只)，同樣方法繼續(xù)觀察，計算第2批蚊幼蟲的感染率。

1.2.2模擬室外滅蚊實驗采用室外人工模擬法，取塑料小桶盛自來水4 L，加入滅菌泥土50 g，滅菌木屑8 g。設(shè)立純貴陽腐霉組(加入含貴陽腐霉菌絲體約63.6 cm2的瓊脂塊)、貴陽腐霉加Bti組(加入含貴陽腐霉菌絲體約63.6 cm2的瓊脂塊及5日菌齡Bti懸液1 mL)、貴陽腐霉加真菌D組(加入含貴陽腐霉菌絲體約63.6 cm2的瓊脂塊及真菌D)、貴陽腐霉加Bti加真菌D組及對照組(僅加瓊脂塊)。不定期向各組桶內(nèi)加入致倦庫蚊卵塊。每桶內(nèi)設(shè)尼龍網(wǎng)兜，加入貴陽腐霉后第111天和273天加入2～3齡蚊幼蟲(哨位蚊)，于加入蚊幼蟲48 h觀察蚊幼蟲感染率及死亡情況。

1.2.3田間觀察選取湖北宜昌菜地蓄水池90 m2,一次性投放液體培養(yǎng)菌絲體200 g(濕重)，于投放菌絲前、投放菌絲后第5、15、30、57及122天，取5勺水，記錄幼蟲只數(shù)，取平均值計算蚊蟲密度，對死蚊進(jìn)行顯微鏡下觀察。

1.2.4貴陽腐霉的腐生生長取致倦庫蚊3日齡幼蟲，先用Bti致死，再加入貴陽腐霉，48 h后取蚊蟲鏡檢，同時取貴陽腐霉對蚊蟲進(jìn)行生物測定的水體中的有機(jī)物塊鏡檢，觀察貴陽腐霉的腐生生長情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，記數(shù)資料采用率(%)表示，數(shù)據(jù)比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1室內(nèi)生物測定

表1結(jié)果顯示，3株貴陽腐霉的感染力有不同，在第2批實驗中蚊蟲的校正感染率、單碗最高感染率和單碗最低感染率明顯高于第1批(P<0.05)。

2.2模擬室外滅蚊結(jié)果

加入貴陽腐霉后第111天時加入哨位蚊，對照組蚊蟲無死亡，而純貴陽腐霉組、貴陽腐霉加Bti組、貴陽腐霉加真菌D組、貴陽腐霉加Bti加真菌D組，收回的蚊蟲全部死亡，顯微鏡下蟲體布滿貴陽腐霉菌絲。加入貴陽腐霉后第273天加入哨位蚊，對照組蚊蟲無死亡，純貴陽腐霉組哨位蚊全部死亡，顯微鏡下蟲體布滿貴陽腐霉菌絲體；但含貴陽腐霉其他組的哨位蚊沒有死亡。

表1　三株貴陽腐霉連續(xù)感染蚊蟲實驗

(1)與第1批同菌株比較，P<0.05

2.3田間滅蚊效果觀察

投放貴陽腐霉液體培養(yǎng)菌絲體第5天蚊蟲密度明顯比投放前減少，投放第15天偶見蚊蟲，投放第30、57天都沒有發(fā)現(xiàn)蚊蟲。當(dāng)時是當(dāng)?shù)匚孟x高發(fā)期，附近未投藥水體蚊蟲密度達(dá)32只/300 mL或以上。投放的第122天，當(dāng)時當(dāng)?shù)亟?jīng)歷7天36 ℃高溫，然后經(jīng)歷暴雨過后觀察，水面有大量2齡幼蟲，取樣顯微鏡下觀察，約80%為死蚊，其中60%蚊體發(fā)現(xiàn)真菌感染；表明貴陽腐霉控制蚊蟲的持效期可達(dá)4個月，并在高溫酷夏之后仍有明顯效果。(見表2)

表2　田間實驗滅蚊結(jié)果

(1)周邊水體觀察蚊蟲密度達(dá)32只/300 mL；(2)經(jīng)過7 d36 ℃高溫，再經(jīng)暴雨后

2.4貴陽腐霉的腐生生長

被Bti殺死的蚊幼蟲尸體長滿貴陽腐霉的菌絲，產(chǎn)生大量孢子囊，并釋放游動孢子。在貴陽腐霉對蚊蟲進(jìn)行生物測定的水體中取出的木屑、蚊蟲飼料顆粒上有大量貴陽腐霉菌絲，見圖1。

3討論

在與蚊蟲的斗爭中，滅蚊劑的持效期是一個非常重要的問題。特別在大面積滅蚊的情況下，根據(jù)課題組經(jīng)驗每月用藥一次比每月用藥三次要節(jié)約2/3的藥劑和人工費(fèi)。在生物滅蚊劑中， Bti的滅蚊效果好，價格便宜，但是持效期一般僅為7 d。其他滅蚊劑，包括化學(xué)殺蟲劑(雙硫磷、倍硫磷、安倍等)和生物滅蚊劑(球形芽孢桿菌)持效期比較長，但是價格都是Bti的幾倍甚至十幾倍。貴陽腐霉具有對環(huán)境友好，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)，如果它有較長的持效期將有利于蚊蟲生物防治的推廣。因此貴陽腐霉的持效期是本課題的研究要點(diǎn)。

在實驗室小型生物測定中，第2批蚊蟲的感染率都比第1批蚊蟲的感染率高，原因可能是貴陽腐霉是活的(這與其他滅蚊細(xì)菌不同)，在前面一輪滅蚊中它通過蚊尸繁殖，因此水體中積累了更多的貴陽腐霉菌絲體和游動孢子，從而提高了貴陽腐霉的感染率。

在室外人工模擬水體中長期觀察中，結(jié)果提示貴陽腐霉在加入蚊蟲孳生水體111 d后，仍然存活，并保持比較強(qiáng)的滅蚊毒力；在加入水體273 d后雖然僅一桶里有貴陽腐霉存在并發(fā)揮滅蚊作用。但273 d代表了所觀察到的貴陽腐霉持效的最長時間。在田間實驗中也得到122 d以后貴陽腐霉還能控制蚊蟲的記錄。說明在有蚊幼蟲存在時，貴陽腐霉行寄生生活，侵入蚊蟲體內(nèi)，分解其器官化為自己的營養(yǎng)，進(jìn)行生長繁殖。當(dāng)水體中蚊蟲稀少時，它可以在水體中的有機(jī)物，甚至是植物的碎片上或蚊尸行腐生生活。因蚊尸可以為貴陽腐霉提供高質(zhì)量的營養(yǎng)物質(zhì)，有利于提高其毒力，所以，貴陽腐霉可以在水體中定植，長期生存，成為環(huán)境中長期控制蚊蟲的重要因素。貴陽腐霉的這個特點(diǎn)非常適合用于蚊蟲的生態(tài)系統(tǒng)控制。即在蚊蟲孳生的生態(tài)環(huán)境中加入貴陽腐霉，伴以其他的控蚊因素(例如天敵等)共同降低蚊蟲的環(huán)境容納量，使它的種群密度不會超過能引起危害的限度，達(dá)到一勞永逸的效果。

當(dāng)然，實際現(xiàn)實中各種情況均可能發(fā)生。若生態(tài)系統(tǒng)的平衡被某因素打破，造成蚊蟲種群爆發(fā)，這時必須采用其他手段包括化學(xué)殺蟲劑，迅速撲滅蟲情。針對不同情況，采用不同的治蚊手段，這也就是基于生態(tài)學(xué)原理的多學(xué)科手段有機(jī)結(jié)合的蚊蟲綜合治理方法(IPM)[7-8]。

4參考文獻(xiàn)

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[7]Richard C. Axtell Principles of integrated pest management (IPM) in relation of mosquito control [J] . Mosquito News, 1979 (4): 709-718.

[8]陸寶麟.蚊蟲綜合治理[J].昆蟲學(xué)報， 1978(2)：217-232.

(2015-12-20收稿，2016-02-28修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 周凌

A Study on Persistence ofPythiumguiyangensein Mosquito Breeding Environment

YANG Xiao1, WANG Yanhui2, SU Xiaoqing1,3

(1.YingjiahangS.T.Co.LTD,Zhuhai519060,Guangdong,China; 2.YichanganruipuBiologySicience&TechnologyCompanyLTD,Yichang443000,Hubei,China; 3.DepartmentofBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To study the persistence of virulence of Pythium guiyangense (Pg). Methods: (1) Using the fungal mycelia to infect 2 batches of mosquito larvae consecutively, and to compare their mortality rates and infection rates; (2) using sentinel mosquitoes to monitor the fungal virulence to mosquito larvae in long-term in out door artificial water containers, which were divided into groups of control (C), Pg (P), Pg plus Bti (PB),Pg plus fungus D (PD), and Pg plus Bti and fungus D (PBD). Sentinel mosquitoes were put in containers on the 111(st) and 273(rd) days after microbe application, and were taken into the lab in 48h later. The mortality rates and infection rates of these mosquitoes were used to show the situation of Pg;(3) Field trail: suspension of Pg mycelia was applied in a vegetable field water reservoir,and the mosquito density inside was observed before and 5, 15. 30. 57 and 122 days after the application was observed and compared. (4)Observing saprophytic growth of Pg: residue in Pg bioassay containers and mosquitoes that killed by Bti and then incubated with Pg were observed with microscope for Pg mycelia. Results: (1) In lab continuous test with 3 strains of Pg, all the adjusted infection rates in groups, highest and lowest infection rates in individual containers of the second batch of mosquitoes were higher than those of the first batch. (2) In outdoor artificial water body test, the sentinel mosquitoes from groups P, PB, PD, and PBD of the 111(st) day all died and infected with Pg while no sentinel mosquito from group C died. For the sentinel mosquitoes on the 273(rd) day, all the sentinel mosquitoes from group P died and infected with Pg, although no mosquito from other groups died. (3)Field trial showed that mosquito density in 5 days after the application of Pg was significantly lower than that before, and the density dropped sharply thereafter. No larvae was found on the 30(th) and 57(th) days. The latest day of observation was the 122(ed) day of application when about 80% mosquito larvae died, of which 60% were found infected by Pg. (4)Pg mycelia were found from mosquito corpses and organic matter from Pg bioassay containers. Conclusions: Pg can control mosquito larvae in mosquito breeding water for long duration. The observed longest persistence was 273 days in our studies.

[Key words]Pythium guiyangense; fungus; mosquito biological control; long-acting formula

[中圖分類號]R184.31; R379;Q939.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)03-0254-04

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No：30760140)

**通信作者 E-mail:su.xiaoqing@aliyun.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-03-17網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1012.010.html