嚴(yán)亞鋒，白海俠，史亞軍陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽712046

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腦清通顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究*

嚴(yán)亞鋒，白海俠，史亞軍
陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽712046

［摘要］目的：建立腦清通顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法(TLC)法鑒別方中決明子、川芎、山楂和水蛭，采用高效液相色譜法(HPLC)法測定赤芍中芍藥苷的含量。結(jié)果：決明子、川芎、山楂和水蛭TLC色譜斑點(diǎn)清晰，無干擾，芍藥苷在0.0216～0.1944mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9997），平均加樣回收率為99.19％，RSD=1.13％。結(jié)論：所建立的薄層鑒別方法斑點(diǎn)清晰、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，含量測定方法分離度好、結(jié)果準(zhǔn)確，可有效控制腦清通顆粒的質(zhì)量。

［關(guān)鍵詞］腦清通顆粒；芍藥苷；決明子；川芎；山楂；水蛭

Study on Quality Standard of NaoQingTong Granules

YAN Yafeng,BAI Haixia,SHI Yajun
Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046,China

AbstractObjective:To establish quality standard of NaoQingTong granules.Methods:JueMingZi (Semen Cassiae),ChuanXiong (Ligusticum chuanxiong Hort.),ShanZha(Crataegus pinnatifida Bunge)and ShuiZhi(Whitmania pigra Whitman) in the prescription were identified by TLC method,the contents of peoniflorin was determined in ChiShao by using HPLC method.Results:Chromatographic spots of JueMingZi,ChuanXiong,ShanZhan and ShuiZhi were clear,and the blank test showed no interference,peoniflorin demonstrated better linear relationship in the range between 0.021 6 and 0.194 4 mg/mL(r=0.9 99 7),average recovery rate was 99.19％,RSD=1.13％.Conclusion:The TLC method,showing clear spots,high specificity,reproducible,good separation and accurate,could be used for quality control of NaoQingTong granules.

Keywords NaoQingTong granules;peoniflorin;JueMingZi;ChuanXiong;ShanZha;ShuiZhi

腦清通顆粒是首屆國醫(yī)大師，著名中醫(yī)內(nèi)科專家，博士、碩士研究生導(dǎo)師，中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)常務(wù)理事，國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)急癥、腦病協(xié)作組組長，陜西省首屆名老中醫(yī)，陜西中醫(yī)學(xué)院名譽(yù)院長、終身教授，陜西中醫(yī)學(xué)院原院長張學(xué)文教授數(shù)十年治療眩暈(高血壓)、中風(fēng)等表現(xiàn)為肝熱痰瘀證等疾病的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由決明子、丹參、姜半夏、野菊花、豨簽草、川芎、赤芍、水蛭、生山楂等中藥組成，具有清肝活血、滌痰通絡(luò)之功效，多用于眩暈、頭痛、中風(fēng)先兆、中風(fēng)等肝熱痰瘀證疾病。筆者對方中決明子、川芎、山楂和水蛭采用薄層色譜(TLC)法進(jìn)行了鑒別研究［1-2］，對赤芍所含芍藥苷采用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行含量測定研究［1，3-4］，該薄層鑒別方法和含量測定方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可有效控制腦清通顆粒的產(chǎn)品質(zhì)量。

1　儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(Angilent Technologies)、Angilent C18色譜柱、十萬分之一電子天平(梅特勒)、超聲波清洗機(jī)(深圳和科達(dá)超聲儀器有限公司提供)、DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司提供)、電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司提供)、三用紫外分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司提供，WFH-201B紫外投射反射儀)、雙槽層析缸(規(guī)格200 mm×200 mm)。

1.2試藥芍藥苷對照品(批號：110736-201136)；山楂對照藥材(批號：121137-201003)、水蛭對照藥材(批號：12106-200503)、川芎對照藥材(批號：110736-200424)、赤芍對照藥材(批號：121092-200402)、決明子對照藥材(批號：121544-201007)、大黃酚對照品(批號：110796 -200514)，均由中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純、磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))、娃哈哈純凈水。其他試劑均為分析純，購自西安化學(xué)試劑廠；腦清通顆粒由陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑中心制備(批號：130501、130502、130503)。

2　方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別

2.1.1決明子稱取本品3 g，加甲醇25 mL，浸漬1小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，加鹽酸2 mL，水浴加熱回流30分鐘，放冷，用乙醚萃取2次，25 mL/次，合并乙醚液，水浴蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。另取陰性樣品(缺決明子)3 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。再取決明子對照藥材1 g，加甲醇20 mL，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。再取大黃酚對照品，用無水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)溶液配制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)-丙酮(2∶1)的溶液為展開劑，展開，取出，自然晾干。供試品色譜中，分別在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的黃色斑點(diǎn)，陰性對照在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上無干擾。見圖1。

圖1　決明子的TLC圖譜

2.1.2川芎稱取本品6 g，加乙醚50 mL，置水浴上回流1小時(shí)，濾過，濾液水浴蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?mL使溶解，作為供試品溶液。另取陰性樣品(缺川芎)6 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。再取川芎對照藥材1 g，加乙醚25 mL，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。吸取上述3種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)溶液為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的亮藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性對照在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上無干擾。見圖2。

圖2　川芎的TLC圖譜

2.1.3山楂稱取本品4 g，加乙醇25mL，置水浴加熱回流20分鐘，濾過，濾液水浴蒸干，加20 mL水使溶解(加熱)，以水飽和的正丁醇15 mL提取，分層后取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取陰性樣品(缺山楂)4 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。再取山楂對照藥材1 g，加乙醇20 mL，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。吸取上述3種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮(9∶1)溶液為展開劑，展開，取出，晾干。噴10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的暗紅色斑點(diǎn)，陰性對照在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上無干擾。見圖3。

圖3　山楂的TLC圖譜

2.1.4水蛭取本品20 g，加乙醇50 mL，超聲15分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液。另取陰性樣品(缺水蛭)20 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。再取水蛭對照藥材1 g，加乙醇10 mL，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(4∶1)溶液作為展開劑，展開，取出，晾干。噴10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫色斑點(diǎn)，陰性對照在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上無干擾。見圖5。

圖4　水蛭的TLC圖譜

2.2芍藥苷含量測定

2.2.1色譜條件色譜柱：Angilent C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1％磷酸溶液(14∶86)；檢測波長：230 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；理論板數(shù)按芍藥苷計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2.2供試品溶液的制備取本品適量，研細(xì)，取2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定質(zhì)量量，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3對照品溶液的配制精密稱取芍藥苷對照品5.40 mg，加甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，搖勻，取2 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍考察精密稱取芍藥苷對照品10.80 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液待用。精密吸取儲(chǔ)備液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，在“2.2.1”色譜條件下測峰面積。以峰面積對芍藥苷濃度進(jìn)行線性回歸，得線性方程為：Y=981.27X-24.55，r=0.999 7。結(jié)果表明：芍藥苷在0.021 6～0.194 4 mg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5干擾實(shí)驗(yàn)照處方比例制備缺赤芍的陰性樣品，取2.0 g，按供試品溶液制備方法制備成陰性對照溶液。精密吸取陰性對照溶液、對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件測定，結(jié)果陰性對照在芍藥苷峰部位無干擾。見圖5。

圖5　腦清通顆粒HPLC色譜圖

2.2.6精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一份供試品(批號：130501)溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值，芍藥苷含量的RSD=1.04％(n=6)。結(jié)果表明，本法精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一批號的供試品(批號：130501)溶液，分別于0、2、4、6、8小時(shí)精密吸取10 μL，按上述色譜條件測定峰面積積分值，芍藥苷含量的RSD=2.20％(n=5)，表明在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號供試品(批號：130501)6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定芍藥苷峰面積積分值，并計(jì)算得平均含量為2.24 mg/g，其含量的RSD=1.96％(n=6)。

2.2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)稱取批號為130501 (2.24 mg/g)的樣品6份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入芍藥苷對照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，并按“2.2.1”色譜條件測定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.19％，RSD=1.13％(n=6)。見表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.10樣品含量測定取3批樣品，依“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，并按上述色譜條件測定，結(jié)果如下：批號：130501，含量2.24 mg/g，批號：130502，含量2.17 mg/g，批號：130503，含量2.11 mg/g。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)曾對姜半夏、丹參、野菊花、豨薟草、石菖蒲等藥材也進(jìn)行了薄層色譜鑒別，但由于干擾明顯、重復(fù)性差等，結(jié)果均不理想，有待進(jìn)一步研究。含量測定研究中供試品溶液制備方法曾比較了超聲提取和回流提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者提取效果無明顯差異，考慮超聲提取簡單、省時(shí)，因此選擇超聲提取。對超聲時(shí)間也進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)30分鐘即可將芍藥苷提取完全?？疾炝思状?0.05 mol/L磷酸二輕鉀溶液、乙腈-0.1％磷酸溶液等流動(dòng)相，并進(jìn)行了多種比例的調(diào)整，結(jié)果以乙腈-0.1％磷酸溶液(14∶86)比例分離度、重復(fù)性等均較理想，因此確定此流動(dòng)相。根據(jù)3批樣品測定結(jié)果，考慮到藥材產(chǎn)地及每批次有效成分含量存在差異，因此暫定本品每袋含赤芍以芍藥苷(C23H28O11)計(jì)，不得少于1.50 mg。

參考文獻(xiàn)

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［4］張靜，楊俊，李娟.HPLC法測定消乳散結(jié)膠囊中芍藥苷的含量［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，17(2):73-74.

作者簡介：嚴(yán)亞鋒(1976—)，男，碩士學(xué)位，講師，工程師，執(zhí)業(yè)藥師。研究方向：老年病的中藥防治。

*基金項(xiàng)目：陜西省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號2013JK0831，14JK1195)。

收稿日期：2015-02-27

［中圖分類號］R283

［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A

［文章編號］1004-6852(2016)02-0023-04