張煥鑫，趙金河湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北十堰442000

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黃連素對(duì)實(shí)驗(yàn)性再狹窄模型血管內(nèi)皮功能的影響

張煥鑫，趙金河
湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北十堰442000

［摘要］目的：探討黃連素對(duì)兔頸動(dòng)脈球囊損傷后血一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素-1（ET-1）水平及血管形態(tài)改變的影響，并初步探討其改善血管內(nèi)皮功能的可能機(jī)制。方法：將40只日本大耳白兔，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、黃連素組和辛伐他汀組，除假手術(shù)組外各組均以球囊導(dǎo)管擴(kuò)張損傷頸動(dòng)脈內(nèi)膜，并分別給予生理鹽水、黃連素注射液和辛伐他汀配制液2.5 mg/（kg·d）腹腔注射，假手術(shù)組僅普食喂養(yǎng)。分別于術(shù)后3、7及15天探測(cè)各組右頸總動(dòng)脈直徑，并于耳緣靜脈采血，檢測(cè)血清NO含量及血漿ET-1濃度;取15天時(shí)的頸動(dòng)脈切片于光鏡下觀察。結(jié)果：術(shù)后3、7及15天，黃連素組血清NO含量與假手術(shù)組無(wú)明顯差異，但顯著高于模型組及辛伐他汀組（P＜0.05）；黃連素組和辛伐他汀組血漿ET-1水平與假手術(shù)組均無(wú)明顯差異，但顯著低于模型組（P＜0.05）；術(shù)后15天，黃連素組和辛伐他汀組血管直徑較假手術(shù)組均無(wú)明顯差異，但顯著大于模型組（P＜0.05）；黃連素和辛伐他汀組新生內(nèi)膜中的平滑肌細(xì)胞較同期模型組明顯減少（P＜0.05），泡沫細(xì)胞、纖維結(jié)締組織較少，內(nèi)皮較完整光滑，內(nèi)膜增生較輕。結(jié)論：黃連素可能通過(guò)抑制兔頸動(dòng)脈球囊損傷后NO濃度降低和ET-1水平升高，抑制新生內(nèi)膜增生、改善血管內(nèi)皮功能。

［關(guān)鍵詞］心血管再狹窄；內(nèi)皮功能；黃連素；辛伐他?。灰谎趸?；內(nèi)皮素-1；兔；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Influence of Berberine on Venous Endothelial Function of Experimental Model of Restenosis

ZHANG Huanxin,ZHAO Jinhe
Cardiovascular Department of Affiliated People′s Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China

Abstract Objective:To explore the possible mechanism of berberine improving venous endothelial function initially through discussing its influence on the levels of nitric oxide(NO) and endothelin-1 (ET-1) of the rabbits with carotid artery balloon injury.Methods:Forty rabbits were randomly allocated to sham operation group,the model group,berberine group and simvastatin group,except sham operation group,the rabbit models in other groups were prepared by balloon catheter dilation injuring carotid artery intima,and they accepted peritoneal injection of physiological saline,berberine injection and simvastatin preparation solution in the concentrations of 2.5 mg/(kg·d),sham operation group were fed with common food.The diameters of right common carotid artery in different groups were measured in three,seven and 15 days after the operations,and blood was drawn from auricular vein,the contents of NO and the concentrations of ET-1 were detected;carotid artery slice in 15 days after the operation was observed under light microscope.Results:In three,seven and 15 days after the operations,there was no significant difference between the berberine group and sham operation group in the contents of No,but the berberine group was higher than the model group and simvastatin group significantly (P＜0.05);No significant difference was existed in the comparison among the berberine group,simvastatin group and sham operation group in the levels of ET-1,but the berberine group and simvastatin group were lower than the model group remarkably in the levels of ET-1 (P＜0.05);in 15 days after the operation,there was no significant difference in the comparison among the berberine group,simvastatin group and sham operation group in vessel diameter,the berberine group and simvastatin group were larger than the model group in vessel diameter (P＜0.05);smooth muscle cells decreased in new intima in the berberine group and simvastatin group compared with the model group at the same time obviously(P＜0.05),foam cells and fibrous connective tissue were less,endothelium was complete and smooth,endometrial hyperplasia was more light.Conclusion:Berberine could inhibit new endometrial hyperplasia and improve vascular endothelial function by decreasing the concentrations of NO and raising the level of ET-1 after inhibiting rabbit carotid artery balloon injury.

Keywords cardiovascular restenosis;endothelial function;berberine;simvastatin;NO;endothelin-1;rabbits;experimental animals

經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty，PTCA)后3～6個(gè)月的再狹窄率高達(dá)30％～50％［1］，即使行支架植入仍有發(fā)生支架內(nèi)再狹窄的可能。目前對(duì)于再狹窄的確切機(jī)制尚不十分清楚，但內(nèi)皮功能障礙是其主要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物不僅可有效降低膽固醇，還可減輕炎癥反應(yīng)，抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，改善血管內(nèi)皮功能。相關(guān)研究表明，黃連素不僅具有抗菌作用，還具有降脂作用，并能抑制平滑肌細(xì)胞增殖、改善血管內(nèi)皮功能［2-3］。本實(shí)驗(yàn)以辛伐他汀為對(duì)照，通過(guò)對(duì)內(nèi)皮源性血管活性因子一氧化氮(Nitric Oxide，NO)、內(nèi)皮素-1 (Endothelin-1，ET-1)水平及血管形態(tài)的觀測(cè)，探討黃連素在改善血管內(nèi)皮功能方面的作用。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物分組選取健康清潔級(jí)日本大耳白兔40只(武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量2.3～2.8 kg，平均(2.6±0.2)kg，雌雄不拘，分籠喂養(yǎng)，自由飲水。1周后隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=7)、模型組(n=11)、小檗堿組(n=11)和辛伐他汀組(n=11)。

1.2模型復(fù)制與分組處理暴露并游離右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，于右頸總動(dòng)脈近心側(cè)距頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉4～5 cm處及右頸內(nèi)動(dòng)脈起始處用動(dòng)脈夾夾閉，在右頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心側(cè)，距頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉約1 cm處結(jié)扎。于右頸外動(dòng)脈結(jié)扎處近端穿一細(xì)線備用，并剪一“V”型小口(約為管周1/3)，血管鉤拉起切口，直視下逆行插入球囊導(dǎo)管(強(qiáng)生公司提供，Φ2.5 mm×20 mm)至動(dòng)脈夾處，連接壓力泵(麥瑞特公司提供)，以5～6 atm擴(kuò)張球囊，重復(fù)3次，30 s/次，緩慢回拉導(dǎo)管，逐段擴(kuò)張至切口處，退出球囊，在切口近端結(jié)扎右頸外動(dòng)脈。假手術(shù)組不行球囊擴(kuò)張，余步驟同上［4］。術(shù)后肌注青霉素80萬(wàn)U/d，連續(xù)3天，預(yù)防感染。黃連素組予2.5 mg/(kg·d)黃連素注射液(安徽蚌埠制藥廠，10 mg/支)腹腔注射，辛伐他汀組予2.5mg/(kg·d)辛伐他汀原粉(美國(guó)默克公司，批號(hào)：FR-047)配制液腹腔注射，模型組腹腔注射等量生理鹽水，假手術(shù)組僅予普通飲食，至術(shù)后15天實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中模型組與辛伐他汀組因感染、創(chuàng)傷等原因死亡4只。

1.3右頸總動(dòng)脈直徑超聲檢測(cè)各組動(dòng)物分別在術(shù)后3、7、15天于采血前用全數(shù)字化高分辨力彩色超聲診斷儀Sequioa 512(Acuson公司)探測(cè)各組右頸總動(dòng)脈管腔直徑。

1.4血液采集與生化指標(biāo)檢測(cè)各組動(dòng)物分別于術(shù)后3、7、15天空腹耳緣靜脈采血4mL，取2mL注入干燥試管，待自凝后，4000r/min離心10分鐘，分離血清；余下2mL注入含有7.5％EDTA·Na230μL和抑肽酶40μL的試管中混勻，4℃3600r/min離心10分鐘，分離血漿。所有血樣均保存于-20℃待測(cè)。檢測(cè)前室溫下復(fù)融，采用硝酸還原酶法，使用英國(guó)CECIL 2041紫外分光光度計(jì)檢測(cè)血漿NO生成量，試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；采用放射免疫法，使用上海SN-697全自動(dòng)雙探頭放射免疫γ計(jì)數(shù)器檢測(cè)血漿ET-1水平，試劑盒購(gòu)于天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5切片制備及形態(tài)學(xué)觀察術(shù)后15天處死全部家兔，暴露并游離右頸總動(dòng)脈，取自頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉以下1 cm處至4～5 cm處約2～3 cm節(jié)段，生理鹽水沖洗后放入10％中性甲醛固定，逐級(jí)乙醇脫水，石蠟包埋，間斷均勻切片(每片厚4 μm)，行HE染色，于光鏡下觀察受損血管組織形態(tài)學(xué)改變并照相。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1頸動(dòng)脈管腔直徑超聲檢測(cè)結(jié)果顯示，術(shù)后3天及7天各組之間比較，管腔直徑無(wú)明顯差異(P＞0.05)；至15天時(shí)，黃連素組和辛伐他汀組的管腔直徑均顯著大于此時(shí)的模型組(P＜0.05)，且均明顯小于3天時(shí)的管腔直徑(P＜0.05)，但與假手術(shù)組和7天時(shí)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而模型組較假手術(shù)組及3、7天時(shí)的管腔直徑均顯著減小(P＜0.05)；黃連素組與辛伐他汀組比較，在各時(shí)間點(diǎn)上均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1　術(shù)后3、7及15天4組頸動(dòng)脈管腔直徑比較(±s)　mm

表1　術(shù)后3、7及15天4組頸動(dòng)脈管腔直徑比較(±s)　mm

注：*表示與15天時(shí)模型組比較，P＜0.05;#表示與同組3天時(shí)比較，P＜0.05。

組別　只數(shù)　術(shù)后3天　術(shù)后7天　術(shù)后15天假手術(shù)組　7　0.66±0.01　0.65±0.02　0.62±0.02*模型組　9　0.67±0.02*　0.66±0.02*　0.43±0.02黃連素組　11　0.69±0.02　0.66±0.04　0.58±0.03*#辛伐他汀組　9　0.70±0.03　0.67±0.05　0.57±0.02*#

2.2血清NO含量球囊損傷后3、7、15天時(shí)，黃連素組血清NO含量與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，且兩者均顯著高于模型組及辛伐他汀組(P＜0.01)；每組在各時(shí)間點(diǎn)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

2.3血漿ET-1濃度球囊損傷后3、7、15天時(shí)，假手術(shù)組、黃連素組和辛伐他汀組血漿ET-1濃度明顯低于模型組(P＜0.05)，但黃連素組與辛伐他汀組及假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；每組各時(shí)間點(diǎn)間比較，均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表2　術(shù)后3、7、15天4組血清一氧化氮含量變化(±s)　μmol/L

表2　術(shù)后3、7、15天4組血清一氧化氮含量變化(±s)　μmol/L

注：*表示與模型組比較，P＜0.05;#表示與辛伐他汀組比較，P＜0.05。

組別　只數(shù)　術(shù)后3天　術(shù)后7天　術(shù)后15天假手術(shù)組　7　70.53±8.19*#　71.47±8.33*#　70.21±16.49*#模型組　9　22.92±5.77　26.15±5.69　31.87±13.33黃連素組　11　60.29±6.77*#　63.55±6.43*#　65.20±12.70*#辛伐他汀組　9　33.51±4.12　38.35±4.33　40.15±16.01

表3　術(shù)后3、7、15天4組血漿內(nèi)皮素-1水平變化(±s)　pg/mL

表3　術(shù)后3、7、15天4組血漿內(nèi)皮素-1水平變化(±s)　pg/mL

注：*表示與模型組比較，P＜0.05;#表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05。

組別　只數(shù)　術(shù)后3天　術(shù)后7天　術(shù)后15天假手術(shù)組　7　55.38±7.73*　52.25±7.68*　54.91±10.14*模型組　9　92.39±8.94　93.47±9.12　91.19±15.94黃連素組　11　67.61±7.44*#　61.88±7.33*#　58.39±10.71*#辛伐他汀組　9　67.06±4.58*#　65.38±8.71*#　62.44±13.18*#

2.4組織形態(tài)學(xué)觀察HE染色后，光鏡下可見(jiàn)頸動(dòng)脈壁分為內(nèi)膜、中膜和外膜，內(nèi)膜和中膜以波浪狀的內(nèi)彈力板為界，中膜和外膜以外彈力板為界。假手術(shù)組頸動(dòng)脈內(nèi)膜平滑、無(wú)增厚，內(nèi)膜下可見(jiàn)扁平狀內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)彈力板完整，平滑肌細(xì)胞核呈梭形，見(jiàn)圖1。模型組血管內(nèi)膜增生嚴(yán)重，內(nèi)膜修復(fù)不完整，內(nèi)彈力板不連續(xù)，腔內(nèi)面不光滑，可見(jiàn)大量平滑肌細(xì)胞由中膜向內(nèi)膜遷移并增生，細(xì)胞排列紊亂，并有大量泡沫細(xì)胞及纖維結(jié)締組織形成，內(nèi)膜明顯增厚，見(jiàn)圖1。黃連素組和辛伐他汀組新生內(nèi)膜有所增厚，平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，可見(jiàn)少許泡沫細(xì)胞、纖維結(jié)締組織形成，但內(nèi)皮相對(duì)完整光滑，見(jiàn)圖1。

圖1　組織病理學(xué)表現(xiàn)

3　討論

近年來(lái)，對(duì)于血管內(nèi)皮功能的研究一直是血管受損后再狹窄研究中的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、動(dòng)脈彈性以及血清炎性因子可能在亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要的協(xié)同作用［5］。血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅具有屏障的作用，還是一個(gè)高度活躍的代謝庫(kù)，可起到抗血栓的作用并且可以合成多種血管活性物質(zhì)，影響血管舒縮、凝血、抗凝、血液流動(dòng)性等多方面的功能，對(duì)其起到調(diào)節(jié)作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷以及功能異?？梢鸲喾N疾病，是多種疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)，尤其對(duì)于心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展起重要作用［6］。

NO和ET-1是兩種最重要的內(nèi)皮源性血管活性因子，二者作用相反，在維持血管正常結(jié)構(gòu)和功能方面起重要作用。ET-1不僅具有強(qiáng)大的長(zhǎng)效縮血管、促血小板和單核巨噬細(xì)胞聚集、黏附作用，還是強(qiáng)大的促平滑肌細(xì)胞增生因子，能刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成。與之相反，NO則是內(nèi)皮合成和分泌的最重要擴(kuò)血管物質(zhì)之一，能夠抑制平滑肌細(xì)胞的有絲分裂及DNA的合成。正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)平衡血管舒張因子(NO)和血管收縮因子(ET-1)的含量來(lái)維持正常的內(nèi)皮功能。內(nèi)皮損傷時(shí)，血漿ET水平升高和(或)NO水平下降時(shí)，兩者比例失衡，可導(dǎo)致血管舒張功能異常［7］。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，球囊損傷后3、7、15天，黃連素組和辛伐他汀組的血漿ET-1水平明顯低于模型組，而與假手術(shù)組比較無(wú)明顯差異，提示黃連素和辛伐他汀具有抑制ET-1釋放的作用，治療過(guò)程中ET-1濃度似有降低趨勢(shì)，可能與內(nèi)皮功能逐漸好轉(zhuǎn)或恢復(fù)有關(guān)；黃連素組血清NO濃度顯著高于模型組，而與假手術(shù)組比較無(wú)明顯差異，提示黃連素具有抑制NO下降的功能，辛伐他汀組在本實(shí)驗(yàn)中升高NO的作用不明顯，提示辛伐他汀降低ET-1濃度與升高NO水平的作用可能沒(méi)有直接關(guān)系。同時(shí)，15天時(shí)，黃連素組和辛伐他汀組的血管直徑較模型組大，提示黃連素和辛伐他汀可能通過(guò)抑制ET-1的釋放和NO的減少，以舒張血管、改善內(nèi)皮功能；較3天時(shí)明顯縮小但與7天時(shí)比較無(wú)顯著差異，可能是由于7～15天時(shí)血管的代償性擴(kuò)張較前加劇，并隨著藥物對(duì)內(nèi)皮功能的修復(fù)作用逐漸增強(qiáng)，使得因內(nèi)膜受損導(dǎo)致的局部血管收縮與彈性回縮明顯緩解所致。結(jié)合光鏡下形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，15天時(shí)黃連素組和辛伐他汀組新生內(nèi)膜有所增厚，有平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，可見(jiàn)少許泡沫細(xì)胞、纖維結(jié)締組織形成，但內(nèi)皮相對(duì)完整光滑，提示黃連素可能通過(guò)維持NO/ET-1的相對(duì)平衡，抑制平滑肌細(xì)胞從中膜向內(nèi)膜增殖、遷移而減輕新生內(nèi)膜的增生和血管的重塑。

以往研究顯示，黃連素可以上調(diào)低密度脂蛋白受體(LDLR)，單獨(dú)或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用均可顯著降低總膽固醇、低密度脂蛋白、ApoB和甘油三酯含量，增加高密度脂蛋白的表達(dá)水平，可以用于舒緩血脂障礙和降低心血管疾病的危險(xiǎn)［3，8］；黃連素還具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用［9］，故可防止脂質(zhì)在內(nèi)膜沉積，減少和抑制低密度脂蛋白氧化生成氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL)。Ox-LDL作為動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要危險(xiǎn)因素之一，可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙，引起NO合成減少，ET-1分泌增加，而內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及功能改變是動(dòng)脈粥樣硬化形成的初始改變［10-11］。因此推測(cè)，黃連素亦可能通過(guò)降脂、抗氧化作用的途徑直接或間接抑制新生內(nèi)膜增生，保護(hù)血管內(nèi)皮并維持其功能，但尚需更深入的研究來(lái)證實(shí)。

綜上所述，兔頸動(dòng)脈球囊損傷后腹腔注射黃連素，可使血清NO含量升高、血漿ET-1濃度下降，使管腔直徑增加、內(nèi)膜增生程度減輕，提示黃連素保護(hù)血管內(nèi)皮功能、抑制新生內(nèi)膜增生和血管重塑的機(jī)制可能與其提示黃連素可能通過(guò)升高NO濃度和/或降低ET-1水平以維持NO/ET-1的相對(duì)平衡有關(guān)，但更長(zhǎng)時(shí)間的影響尚需進(jìn)一步探究。同時(shí)，冠心病的發(fā)生發(fā)展與一氧化氮合酶/一氧化氮(NOS/NO)的功能異常有密切關(guān)系［12］。因此，探討NOS/NO對(duì)內(nèi)皮功能的影響將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

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作者簡(jiǎn)介：張煥鑫(1978—)，男，碩士學(xué)位，副主任醫(yī)師。研究方向：心血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。

收稿日期：2015-07-20

［中圖分類號(hào)］R285.5

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1004-6852(2016)02-0019-04