姚金華，馬　駿，杜志榮，夏小軍，段　赟，田　瑩，范曉娜，王生梅慶陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅慶陽(yáng)75000；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理學(xué)科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室；慶陽(yáng)市西峰區(qū)疾病預(yù)防控制中心；甘肅省腫瘤醫(yī)院

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黃鼬干粉膠囊對(duì)再生障礙性貧血模型小鼠造血功能的影響*

姚金華1，馬駿2△，杜志榮3，夏小軍4，段赟4，田瑩1，范曉娜1，王生梅1
1慶陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅慶陽(yáng)745000；2甘肅中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理學(xué)科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室；3慶陽(yáng)市西峰區(qū)疾病預(yù)防控制中心；4甘肅省腫瘤醫(yī)院

［摘要］目的：觀察黃鼬干粉膠囊對(duì)再生障礙性貧血（AA）模型小鼠造血功能的影響及作用機(jī)制。方法：采用X射線+環(huán)磷酰胺+氯霉素復(fù)合方法復(fù)制小鼠AA模型，觀察黃鼬干粉膠囊對(duì)小鼠外周血象、骨髓有核細(xì)胞數(shù)（BMNC）、骨髓粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落生成單位（CFU-GM）、血清中可溶性細(xì)胞間黏附因子1（sICAM-1）和骨髓組織病理學(xué)的影響。結(jié)果：黃鼬干粉膠囊能明顯增加模型小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT數(shù)量，能增加骨髓BMNC數(shù)量，還能升高骨髓CFU-GM和降低血清sICAM-1。與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。骨髓組織病理學(xué)結(jié)果表明，黃鼬干粉能明顯改善模型小鼠骨髓增生低下和造血灶減少，促進(jìn)骨髓造血。結(jié)論：黃鼬干粉膠囊能改善AA模型小鼠造血功能，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)骨髓CFU-GM和血清sICAM-1的平衡有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］黃鼬干粉膠囊；再生障礙性貧血；外周血象；骨髓有核細(xì)胞數(shù)；骨髓粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落生成單位；血清中可溶性細(xì)胞間黏附因子1；組織病理

Influence of Yellow Weasel Dry Powder Capsules on Hemopoiesis of Mice Model with Aplastic Anemia

YAO Jinhua1,MA Jun2△,DU Zhirong3,XIA Xiaojun4,DUAN Yun4,TIAN Ying1,FAN Xiaona1,WANG Shengmei1
1 Qingyang Municipality TCM Hospital,Qingyang 745000,China;2 Three-step Lab for Pharmacology of Chinese Materia Medica of State Administration of Traditional Chinese Medicine of the People′s Republic of China of Gansu University of Traditional Chinese Medicine;3 Xifeng District Center for Disease Control and Prevention of Qingyang Municipality 4 Gansu Provincial Cancer Hospital

Abstract Objective:To observe the influence of yellow weasel dry powder capsules on hemopoiesis of mice model with aplastic anemia (AA) and the mechanism.Methods:Mice model with AA was prepared by X-ray,cy-clophosphamide and chloramghenicol,the influence of yellow weasel dry powder capsules on peripheral blood,bone marrow mononuclear cells (BMNC),colony forming unit-granulocyte and macrophage (CFU-GM),soluble intercellular adhesion molecules-1 (sICAM-1) and the histopathology of bone marrow were observed.Results:Yellow weasel dry powder capsules could increase the numbers of HGB,RBC,WBC and PLT in peripheral blood of the mice obviously,increase the amount of BMNC,raise CFU-GM and decrease sICAM-1.Compared with model control group,the difference showed statistical meaning (P＜0.05).Histopathological results of bone marrow demonstrated that yellow weasel dry powder could notably improve hypofunction of bone marrow hyperplasia and the decrease of hemopoietic focus of AA mice,and promote hemopoiesis of bone marrow.Conclusion:Yellow weasel dry powder capsules could effectively improve hemopoiesis of AA mice model,and its mechanism might be related to regulating the balance of CFU-GM and sICAM-1.

Keywords yellow weasel dry powder capsules;AA;peripheral blood;BMNC;CFU-GM;sICAM-1;histopathology

黃鼬(學(xué)名Mustela sibirica)，俗名黃鼠狼，為鼬科小型雜食動(dòng)物［1］。黃鼬肉骨在我國(guó)民間歷來(lái)被視為一種藥材，認(rèn)為具有抗癌、增強(qiáng)免疫力等功效，對(duì)急性白血病(AL)、再生障礙性貧血(AA)、免疫性血小板減少癥等疾病也有一定療效。甘肅隴東地區(qū)民間常以黃鼬干粉用于AA及AL化療后骨髓抑制患者，也用以治療骨髓增生低下性疾病，效果滿意。本實(shí)驗(yàn)擬觀察黃鼬干粉膠囊對(duì)AA模型小鼠骨髓造血功能的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供，實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘) 2010-0001，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號(hào)：0000981。

1.2藥物和試劑黃鼬干粉膠囊(甘肅省慶陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院提供，批號(hào)：130706)，臨用前將藥粉用8倍量蒸餾水浸泡2小時(shí)，水浴鍋煎煮30分鐘，800rpm離心5分鐘，取上清液，80℃濃縮至30％和90％的濃度，4℃冰箱保存?zhèn)溆?；司坦唑醇?廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：130416)；注射用環(huán)磷酰胺(CTX)(山西普德藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：04120103)；氯霉素注射液(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：130523)；注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H13020657)；注射用硫酸鏈霉素(華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20130615)；M199培養(yǎng)基(上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：130811)；馬血清(鄭州益康生物有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：130608)；瓊脂粉(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20130406)；ELISA(sICAM-1)試劑盒(產(chǎn)品型號(hào)E12789，規(guī)格96T，上海華壹生物有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20130522)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器醫(yī)用直線加速器(型號(hào)BD-6M，北京醫(yī)療器械研究所提供)；低溫高速離心機(jī)［Biofuge fresco(美國(guó))］；血細(xì)胞分析儀［CD1200(美國(guó))提供］；奧林帕斯生物顯微鏡［Olympus公司(日本)生產(chǎn)］；BS110S型sartorius電子天平(北京賽多利斯天平有限公司提供)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1對(duì)AA模型小鼠外周血象、骨髓有核細(xì)胞數(shù)（BMNC）和骨髓組織病理學(xué)的影響［2-4］

1.4.1.1分組、造模、給藥取小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組采用醫(yī)用直線加速器X射線一次性全身照射(皮源距100 cm，輻射劑量為8.0 Gy/min，輻射時(shí)間為4分鐘)，分別于第4天、5天、6天腹腔注射環(huán)磷酰胺50.0 mg/kg及氯霉素62.5 mg/kg，連續(xù)3天。造模的同時(shí)，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照藥組灌胃司坦唑醇片1 mg/kg(相當(dāng)于人體臨床日用量的10倍)，黃鼬干粉膠囊高、低劑量組分別灌胃黃鼬干粉膠囊煎液18 g/kg 和6 g/kg(相當(dāng)于臨床人1日用量的30倍和10 倍)。均為0.02 mL/g，各組每天1次，連續(xù)15天。

1.4.1.2外周血象及BMNC計(jì)數(shù)末次給藥后次日，摘眼球取血，用血細(xì)胞分析儀測(cè)定外周血象變化。隨后各組小鼠脫頸椎處死，分離出兩側(cè)股骨。取右側(cè)股骨中段7 mm，用3％冰醋酸溶液10 mL沖出全部骨髓，并經(jīng)6號(hào)針頭抽吸一次，分散骨髓細(xì)胞。然后通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)骨髓有核細(xì)胞數(shù)(BMNC)。

1.4.1.3骨髓切片制備與觀察將左側(cè)股骨浸入4％中性甲醛內(nèi)固定2小時(shí)，再用2％的硝酸脫鈣2小時(shí)，水洗2次，室溫下乙醇梯度脫水各2次，然后用甲液、乙液順序浸透各12小時(shí)，用包埋液封閉，放入-20℃冰箱內(nèi)過(guò)夜，第2天進(jìn)行切片，蘇木素-姬姆薩-伊紅染色，最后置于光學(xué)顯微鏡下觀察骨髓增生程度及造血細(xì)胞變化。

1.4.2對(duì)AA模型小鼠粒-巨噬細(xì)胞集落生成單位（CFU-GM）、可溶性黏附因子1(sICAM-1)的影響［5-8］

1.4.2.1小鼠骨髓CFU-GM的檢測(cè)小鼠分組、模型制備及給藥同上。培養(yǎng)體系為含20％馬血清的M199培養(yǎng)液3.5 mL，5塊0.3 mm3小鼠肺組織生成的細(xì)胞刺激因子，適量青、鏈霉(濃度100 U/mL、100 μg/mL)，分別加入以上各組各時(shí)間點(diǎn)小鼠的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(終濃度為2×105)，置于37℃水浴15分鐘，加入瓊脂0.3 mL(終濃度為0.3％)，再放入2.7％的甲基纖維素(終濃度為0.9％)，振蕩混勻后澆入培養(yǎng)皿，移入含5％ CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)7天，用倒置顯微鏡計(jì)數(shù)各組生成的細(xì)胞集落，≥50個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)為1個(gè)細(xì)胞集落。

1.4.2.2小鼠血清sICAM-1的檢測(cè)末次給藥后，小鼠眼眶靜脈竇取血0.5 mL，室溫放置20分鐘，以3 000 r/min離心20分鐘，取血清5 μ L，按試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)血清中sICAM-1濃度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠外周血象和BMNC比較模型對(duì)照組小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT數(shù)量明顯減少，BMNC數(shù)明顯降低，與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。司坦唑醇片組和黃鼬干粉膠囊高、低劑量組小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT數(shù)量以及BMNC數(shù)量明顯增加，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

正常對(duì)照組骨髓增生活躍，全片有核細(xì)胞密布，巨核細(xì)胞多見。模型對(duì)照組骨髓增生極度低下，造血細(xì)胞明顯減少，大量脂肪細(xì)胞代替造血細(xì)胞，間質(zhì)水腫，巨核細(xì)胞未見。黃鼬干粉膠囊高、低劑量組及司坦唑醇片組仍顯示骨髓增生低下，但可見散在造血灶，偶見巨核細(xì)胞。見圖1。

表1　各組小鼠外周血象和BMNC比較

圖1　各組小鼠骨髓組織病理學(xué)表現(xiàn)（40×）

2.2各組小鼠骨髓CFU-GM、血清SICAM-1比較采用X射線+環(huán)磷酰胺+氯霉素復(fù)合方法復(fù)制小鼠AA模型，模型對(duì)照組小鼠骨髓CFU-GM生成量明顯降低，血清中SICAM-1明顯升高，與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。司坦唑醇片組和黃鼬干粉膠囊高、低劑量組均能提高模型小鼠骨髓CFU-GM生成量，降低小鼠血清中SICAM-1含量，與模型對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2　各組CFU-GM、SICAM-1比較(骨髓細(xì)胞數(shù)4×105)

3　討論

AA是一組由化學(xué)、物理、生物及自身免疫等因素所致的骨髓造血干細(xì)胞和(或)造血微環(huán)境損傷而出現(xiàn)的造血功能衰竭性疾病。其主要的病理改變是紅骨髓向心性萎縮，被脂肪髓代替，無(wú)惡性細(xì)胞及網(wǎng)狀纖維增生，以致外周血液中全血細(xì)胞減少出現(xiàn)貧血、出血、感染等臨床癥狀［9-10］。

AA屬于中醫(yī)“髓勞病”范疇［11］?！侗静菥V目》記載，黃鼬的肉甘、溫，有小毒，入肺、腎二經(jīng)，具有殺蟲療瘡、溫腎縮尿的功效，治疥瘡、瘡潰不愈合、尿頻等癥。甘肅隴東地區(qū)民間AA及AL化療后骨髓抑制的患者大多服用黃鼬干粉［12-13］，但相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，采用X射線+環(huán)磷酰胺+氯霉素復(fù)合方法復(fù)制小鼠AA模型，黃鼬干粉膠囊能明顯增加模型小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT數(shù)量，能增加骨髓BMNC和CFU-GM數(shù)量，降低血清SICAM-1水平。骨髓組織病理學(xué)結(jié)果表明，黃鼬干粉膠囊能明顯改善模型小鼠骨髓增生低下和造血灶減少，促進(jìn)骨髓造血。其治療AA的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)骨髓CFU-GM和血清sICAM-1的平衡有關(guān)。本研究為中醫(yī)臨床使用黃鼬干粉膠囊治療AA和進(jìn)一步新藥研發(fā)提供了藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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通訊作者：△馬駿（1966—)，男，碩士研究生導(dǎo)師，教授。研究方向：中藥藥理學(xué)與安全性評(píng)價(jià)。

作者簡(jiǎn)介：姚金華（1973—），男，副主任醫(yī)師。研究方向：血液病的中西醫(yī)診治。

*基金項(xiàng)目：甘肅省慶陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)2011-1003-NKCM013）。

收稿日期：2015-10-30

［中圖分類號(hào)］R285.5

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1004-6852(2016)02-0012-04