田倪妮，魏 玲，李宏鍵，朱向情，田 青，李慧萍，陳 瑛，潘興華*

(1成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院地方干部病房，昆明 650032；2昆明市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，昆明 650011；3云南省第一人民醫(yī)院骨科，昆明 650034； 4云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032；5桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，桂林 541000)

心室重構(gòu)的基礎(chǔ)是心肌細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)、膠原細(xì)胞網(wǎng)等變化，其相關(guān)過程包括缺血、細(xì)胞壞死和凋亡等。成纖維細(xì)胞首先在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的多聚核糖體上通過信使RNA合成多肽鏈，每3條前肽鏈經(jīng)羥化裝配成一條三股螺旋的前膠原分子，再經(jīng)過糖化前膠原分泌到細(xì)胞外。再由前膠原肽酶切除前膠原的C端和N端前肽而形成膠原。因此Ⅰ型C端膠原前肽(carboxyterminal propeptide of typeⅠprocollagen,PⅠCP)可反映Ⅰ型膠原的合成。

Klotho基因全長50 kb,包括4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子，人類的Klotho基因定位于第13號染色體(13q12)。Klotho是一種與衰老有關(guān)的基因，作為一種輔助因子/復(fù)合受體調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)23信號，影響細(xì)胞內(nèi)信號通路，包括p53/p21、c-AMP、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和Wnt信號通路。Klotho可保護(hù)內(nèi)皮的機(jī)能障礙和調(diào)節(jié)一氧化氮的產(chǎn)生，其基因表達(dá)增加可抑制胰島素信號和氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制衰老和延長壽命。

本課題組通過觀察慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)患者心肌Klotho基因的表達(dá)及PⅠCP的含量變化，討論Klotho基因在CHF患者中的作用，及其與膠原的分泌、合成，以及心肌纖維化的可能關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)樣本取材于成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院2013年8月至2014年8月心臟外科建立體外循環(huán)手術(shù)患者心肌的脫落組織，共計(jì)60例。所有病例均排除腦血管病、急性心肌梗死、嚴(yán)重肝腎功能不全等可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的疾病。根據(jù)紐約心臟聯(lián)合會(New York Heart Association, NYHA)分級標(biāo)準(zhǔn)將60例患者分為：NYHAⅠ級組、NYHAⅡ級組和NYHAⅢ級組，每組各20例。所有標(biāo)本及組織放入-80℃的超低溫冰箱中備用。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 試劑 離心柱型mRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量4.2×SYBR real-time PCR premixure(百泰克生物技術(shù)有限公司，北京)、PⅠCP采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒等。

1.2.2 儀器 熒光定量PCR系統(tǒng)Bio-RAD CFX96-C1000(Applied Biosystems公司，美國)、UVP凝膠成像系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)(Biorad公司，美國)、酶標(biāo)儀。

1.3 心肌組織mRNA的提取

將收集的心肌組織標(biāo)本按照mRNA提取試劑盒說明書提取mRNA，運(yùn)用紫外分光光度計(jì)及1%瓊脂糖凝膠電泳方法檢測其濃度及純度。合格樣本凍存于-80℃超低溫冰箱。

1.4 心肌組織mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA

在聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)管中配制20 μl 反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription, RT)反應(yīng)混合液。按以下條件在PCR儀器上將心肌組織mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：42℃ 50 min，70℃ 10 min，冰盒冷卻，存于-20℃超低溫冰箱。

1.5 RT-PCR 擴(kuò)增目的基因Klotho

Klotho基因引物由上海生工生物工程技術(shù)公司設(shè)計(jì)與合成，Klotho引物約115 bp，甘油醛3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物片段約125 bp。引物設(shè)計(jì)見表1?？偡磻?yīng)體系20 μl，擴(kuò)增條件：95℃ 2 min 起始模板變性，95℃ 45 s模板變性(循環(huán)數(shù)1)；61℃ 5 s退火，72℃ 1 min 延伸(循環(huán)數(shù)35)，72℃ 10 min 延伸(循環(huán)數(shù)1)。將無cDNA的RT管作為陰性對照管，測定各管的CT值，每個(gè)樣本重復(fù)3遍，將NYHAⅠ級組作為對照組。

表1 目的基因引物及內(nèi)參

GAPDH： glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

1.6 患者血清中PⅠCP濃度的測定

ELISA方法檢測本組60例患者血清中PⅠCP濃度。將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體，先后加入受檢標(biāo)本、酶標(biāo)抗體，最后加底物顯色。用酶標(biāo)儀檢測。

1.7 心肌組織的HE染色

采用HE染色法對正常心肌組織和CHF心肌組織進(jìn)行染色。通過取材與固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟HE染色、脫水透明、封固，對心肌標(biāo)本進(jìn)行HE染色。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌組織HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果表明，正常心肌細(xì)胞短柱狀，細(xì)胞核呈橢圓形、深染、染色質(zhì)均勻(圖1A)；CHF患者隨著心功能的逐漸惡化，心內(nèi)膜下心肌彌漫性空泡樣變，心肌間質(zhì)廣泛纖維化(圖1B，C，D)。

圖1 心肌組織HE染色病理切片

2.2 Klotho基因在不同心功能分級組中的相對表達(dá)量

RT-PCR測定Klotho基因在3個(gè)不同心功能分組中的相對表達(dá)量。經(jīng)方差分析得出Klotho基因相對表達(dá)量：NYHAⅠ級組為1.12±0.09；NYHAⅡ級組為0.73±0.18；NYHAⅢ級組為0.37±0.19。Klotho基因相對表達(dá)量在3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩兩比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NYHAⅠ級組高于Ⅱ級組和Ⅲ級組(均P<0.05), NYHAⅡ級組高于Ⅲ級組(P<0.05；圖2)。

2.3 不同心功能分級組患者血清中PⅠCP的含量

ELISA法測定各組血清中PⅠCP含量：NYHAⅠ級組為(0.324±0.053)μg/L,NYHAⅡ級組為(0.435±0.041)μg/L,NYHAⅢ 級組為(0.492±0.077)μg/L。PⅠCP含量在 3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.82,P<0.05)；兩兩比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NYHAⅢ 級組高于Ⅱ級組、Ⅰ級組(均P<0.05)，NYHAⅡ級組高于Ⅰ級組(P<0.05；圖3)。

圖2 各組心肌組織Klotho基因的表達(dá)

圖3 不同心功能分級組血清PⅠCP濃度

3 討 論

心肌纖維化是指在心肌的組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過量積聚，其濃度顯著升高或容積分?jǐn)?shù)顯著增加。近年來大量研究表明，心肌纖維化可發(fā)生于高血壓、心肌梗死及心力衰竭等許多心血管疾病。心肌損傷主要包括心肌細(xì)胞丟失、肥大以及間質(zhì)膠原含量的改變[1,2]。已知的心臟膠原纖維主要有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 5種，而Ⅰ、Ⅲ型膠原占90%以上(Ⅰ型約占80%、Ⅲ型約占12%)，而Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型膠原約占10%～12%[3]。Keene認(rèn)為，Ⅰ型膠原有較大的硬度，有很強(qiáng)的張力，主要聚合成粗纖維網(wǎng)；Ⅲ型膠原有較大的伸展回彈力，形成細(xì)纖維網(wǎng)，兩者共同維持膠原纖維網(wǎng)絡(luò)的完整性，保證心臟的舒縮功能[4]。Ⅰ/Ⅲ型膠原的比值增加會導(dǎo)致心肌硬度增加，從而降低了心室的順應(yīng)性，使心室充盈受阻，室壁擴(kuò)張，最終導(dǎo)致心力衰竭。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)是促進(jìn)心肌間質(zhì)重構(gòu)的重要因素，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)在CHF病程中被激活[5,6]。心肌纖維化亦與心肌凋亡有關(guān)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡與CHOP和Caspase-12有關(guān)，CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，是轉(zhuǎn)錄因子家族C/EBP成員，在正常情況下表達(dá)極低，而當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激時(shí)其表達(dá)顯著被誘導(dǎo)并參與下游細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[7]。Caspase-12的激活能啟動細(xì)胞的凋亡程序，Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的組成蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)能經(jīng)過特定位點(diǎn)的剪切激活誘發(fā)細(xì)胞凋亡，因此，Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡的信號分子[8]。尋求逆轉(zhuǎn)上述病理改變的關(guān)鍵分子對于降低老年心血管疾病的發(fā)病率及猝死率具有重要意義。

Klotho蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的具有抗衰老作用的蛋白，通過膜結(jié)合型和分泌型兩種形式發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)?；谇捌谘芯考拔墨I(xiàn)報(bào)道，我們推測Klotho基因可能具有心血管保護(hù)作用，包括：(1)Klotho蛋白具有抗氧化應(yīng)激作用，而氧化應(yīng)激也參與了心室重構(gòu)；(2)Klotho蛋白可通過增加一氧化氮生物活性或激活血管內(nèi)皮鈣離子通道起到維持血管內(nèi)皮完整性及其功能的作用；(3)Klotho蛋白具有降壓作用；(4)Klotho蛋白抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)。

在人群為基礎(chǔ)的相關(guān)研究中，Klotho基因也和一些衰老表型相關(guān)，例如骨量的減少、骨質(zhì)疏松、動脈硬化和鈣代謝異常[9]。Hu等[10]發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白濃度是預(yù)測社區(qū)中老年人死亡率的獨(dú)立因子。Klotho基因和insulin/IGF-1衰老信號通路相關(guān)，可能通過抵抗氧化應(yīng)激而延遲衰老[11]。

本研究中，在手術(shù)的應(yīng)激狀態(tài)下，各個(gè)心功能分級組中Klotho基因均表達(dá)，但相對表達(dá)量在3個(gè)不同的心功能分級組中有所不同，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩兩比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NYHAⅠ級組高于Ⅱ級、Ⅲ級組(均P<0.05), NYHAⅡ級組高于Ⅲ級組(P<0.05)。ELISA法測定各NYHA分級組血清中PⅠCP含量的結(jié)果表明，PⅠCP含量在組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩兩比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NYHAⅢ級組高于Ⅱ級和Ⅰ級組(均P<0.05)，NYHAⅡ級組高于Ⅰ級組(P<0.05)。HE染色顯示，正常心肌細(xì)胞短柱狀，細(xì)胞核呈橢圓形、深染、染色質(zhì)均勻，而CHF患者可見心肌彌漫性空泡樣變，心肌間質(zhì)廣泛纖維化。隨著CHF患者心室重構(gòu)的發(fā)生、心功能的逐漸惡化，Klotho基因表達(dá)量逐漸減少，提示心功能愈差的患者Klotho分泌愈少，而心肌纖維化指標(biāo)PⅠCP含量逐漸增多。HE染色可見CHF患者心肌間質(zhì)廣泛纖維化，說明隨著心功能的惡化，Klotho蛋白分泌愈少，其抗氧化及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用越弱，抗心肌細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)能力越弱，其對心肌的保護(hù)作用也逐漸減弱。

本研究提示我們，Klotho基因作為抗衰老基因，亦對心血管具有保護(hù)作用。通過增加Klotho基因表達(dá)，延緩膠原的折疊和合成，從而延緩心肌纖維化進(jìn)程，阻斷CHF病情進(jìn)展，這個(gè)新思路對防治CHF有著舉足輕重的作用。

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