林華婷, 呂　峰, 黃國鈔

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

?

Box-Benhnken設(shè)計(jì)優(yōu)化鼠曲草類黃酮超聲波輔助提取工藝

林華婷, 呂峰, 黃國鈔

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

摘要:基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用4因素5水平的Box-Benhnken設(shè)計(jì)，優(yōu)化超聲波輔助提取鼠曲草類黃酮的關(guān)鍵工藝參數(shù).結(jié)果表明，類黃酮提取的最佳工藝條件為：提取溫度35 ℃、乙醇含量73%、超聲波功率350 W、料液比1∶35，在此工藝條件下，超聲波輔助提取50 min，類黃酮的提取率可達(dá)15.25%.

關(guān)鍵詞:鼠曲草; 類黃酮; 超聲波輔助提取; 優(yōu)化

鼠耳草學(xué)名鼠曲草(GnaphliumaffineD.Don)，為菊科鼠麴草屬植物[1]，以野生為主，資源豐富[2].鼠曲草性味甘、平，具有消喉火、解熱、去毒、調(diào)中益氣、止泄，除痰、壓時氣和去熱嗽[3]等功效，可用于感冒咳嗽、支氣管炎、哮喘、高血壓、蠶豆病、風(fēng)濕和腰腿痛等治療，外用于治跌打損傷、毒蛇咬等[4].相關(guān)研究表明，鼠曲草富含揮發(fā)油、氨基酸、多糖和類黃酮等[5]，目前對鼠曲草類黃酮的研究鮮有報(bào)道.

類黃酮廣泛存在于植物中，其基本骨架為C6-C3-C6[6]，具有突出的藥理活性和營養(yǎng)保健作用[7-8].近年來關(guān)于植物類黃酮的提取工藝常有報(bào)道，類黃酮的提取方法主要有浸提法、酶解法、超臨界萃取法和超聲波輔助提取法等[9-10].其中，超聲波輔助提取技術(shù)具有省時、快速、簡單和節(jié)約能源等特點(diǎn)，目前已廣泛用于天然植物有效成分的提取，是一種理想的類黃酮提取方法[11].

Box-Benhnken設(shè)計(jì)可有效快速評價(jià)因素與指標(biāo)間的非線性關(guān)系，確定最佳條件，具有方便、精度高和周期短等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域.本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取鼠曲草類黃酮，基于考察影響提取類黃酮的主要因素，通過Box-Benhnken設(shè)計(jì)[12]，優(yōu)化提取工藝的關(guān)鍵參數(shù)，探索一種快速、簡便和高效提取類黃酮的方法，旨在為鼠曲草的綜合開發(fā)利用及從鼠曲草中提取生物活性成分提供參考.

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料鼠曲草鮮草采自福建屏南地區(qū)，烘干后粉碎過60目篩，備用.

1.1.2試劑蘆丁(生化試劑，純度為98%)由上海恒遠(yuǎn)生物公司生產(chǎn)；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純.

1.1.3儀器設(shè)備主要儀器設(shè)備有BS201分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)、BL-500 A型高速多功能粉碎機(jī)(浙江省康永市松青五金工具廠)、SK8210 LHC超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)、DHG-9240 A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)和UV-1800 PC型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司).

1.2方法

1.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制曲線的繪制參考亞硝酸鈉—硝酸鋁分光光度法[13].準(zhǔn)確稱取蘆丁粉末20 mg，用50%乙醇溶解并定容至100 mL，制得含量為0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液.分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0和25.0 mL于100 mL容量瓶中，各加入1.0 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻放置6 min，再加入1.0 mL 10%硝酸鋁，搖勻放置6 min，最后加入10.0 mL 4%氫氧化鈉，用50%乙醇定容至刻度，搖勻后放置10 min，用紫外可見分光光度計(jì)在波長510 nm處測定其光密度.以光密度為縱坐標(biāo)，樣品含量為橫坐標(biāo)，制得的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：Y=9.105 7X+0.017 5(R2=0.992 5).對照品含量在0~0.06 mg·mL-1的范圍內(nèi)，線性良好.

1.2.2類黃酮提取率的測定與計(jì)算吸取1 mL類黃酮提取液于50 mL容量瓶中，其余方法與“1.2.1”的相同.在510 nm波長處測定類黃酮的光密度(Y)，將Y代入蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，得到提取液中類黃酮的含量(X).

類黃酮提取率/%=(X×n×V/m)×100.式中：X—提取液中類黃酮的含量(mg·mL-1)，n—稀釋倍數(shù)，V—提取液的原體積(mL)，m—鼠曲草樣品質(zhì)量(g).

1.2.3Box-Benhnken設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲波輔助提取類黃酮的關(guān)鍵工藝以前期試驗(yàn)確定的超聲波輔助提取類黃酮的主要影響因素(提取溫度、乙醇含量、超聲波功率、料液比)為變因，以類黃酮提取率為響應(yīng)值，采用4因素5水平的Box-Benhnken設(shè)計(jì)[14]，優(yōu)化類黃酮提取工藝.響應(yīng)面因素水平編碼表見表1.

表1　響應(yīng)面因素水平編碼表

2結(jié)果與分析

2.1Box-Benhnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

為進(jìn)一步確定各因素對類黃酮提取率的影響程度，采用方差分析對所得回歸方程的顯著性及回歸擬合程度進(jìn)行考察[15].響應(yīng)面回歸模型方差分析結(jié)果(表3)顯示：方程回歸極顯著(P<0.000 1)；失擬項(xiàng)P=0.142>0.05，不顯著.表明該回歸方程是可靠的，能夠與實(shí)際情況擬合，可以反映各因素與響應(yīng)值之間的相互作用關(guān)系.

表2　Box-Benhnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3　二次響應(yīng)面回歸模型方差分析1)

1)F表示方程擬合性；P表示模型顯著性，**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05).

2.2試驗(yàn)因素對類黃酮提取率的影響

2.2.1單因素效應(yīng)對回歸方程進(jìn)行降維分析，將提取溫度、乙醇含量、超聲波功率和料液比4個因素中的3個分別固定在零水平上，考察各因素在不同水平上對類黃酮提取率的影響，得到以其中一個因素為決策變量的偏子回歸模型.采用Excel軟件繪制各因素對類黃酮提取率影響的曲線(圖1).

由回歸系數(shù)檢驗(yàn)值F(表3)和圖1可知，在本試驗(yàn)條件下，各因素對類黃酮提取率影響的顯著性大小為：乙醇含量>料液比>超聲波功率>提取溫度.其中，乙醇含量、超聲波功率和料液比對類黃酮提取率的影響極顯著(P<0.01)，提取溫度對提取率的影響不顯著(P>0.05).固定其他3個因素的編碼水平為0時，當(dāng)提取溫度的編碼水平為-2~0(25~35 ℃)時，類黃酮提取率隨著提取溫度的提高而增大至最大值(14.95%)；編碼水平超過0后，類黃酮提取率隨著提取溫度的提高呈微弱下降趨勢.而乙醇含量、超聲波功率和料液比與類黃酮提取率關(guān)系的曲線類似，即乙醇含量、超聲波功率和料液比的編碼水平均為1(分別為75%、350 W和1∶35)時，類黃酮提取率隨著其水平的提高而增大至最大值(分別為15.22%、15.01%和15.12%)；編碼水平超過1后，類黃酮提取率則呈下降趨勢.

2.2.2因素間的互作效應(yīng)根據(jù)回歸方程得到的不同因素對類黃酮提取率影響的三維響應(yīng)面圖和二維平面上的等高線圖如圖2~4所示.每個響應(yīng)面對其中兩個影響因素的交互作用進(jìn)行分析和評價(jià)時，另外兩個影響因素的編碼水平均固定在0上，響應(yīng)面坡度陡峭程度和等高線橢圓形狀反映交互效應(yīng)強(qiáng)弱趨勢.在α=0.01水平上，提取溫度與乙醇含量、乙醇含量與料液比的交互作用對類黃酮提取率有極顯著影響(P<0.01)；在α=0.05水平上，提取溫度與超聲波功率的交互作用對類黃酮提取率有顯著影響(P<0.05).本試驗(yàn)只對上述3個交互作用進(jìn)行分析.

由圖2可知，乙醇含量與提取溫度交互作用的等高線呈橢圓形，表明兩因素的交互作用強(qiáng)，影響極顯著(P<0.01).當(dāng)提取溫度為37.5 ℃，乙醇含量為75%時，對類黃酮提取率的影響呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)交互關(guān)系；反之，當(dāng)提取溫度高于37.5 ℃，乙醇含量高于75%時，兩因素的交互作用對類黃酮提取率的影響則呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)關(guān)系.當(dāng)以乙醇作為提取溶劑時，適當(dāng)提高提取溫度，除了反應(yīng)體系中的分子動能增加外，乙醇中的小氣泡(空化核)增多，對產(chǎn)生空化作用有利.與此同時，隨著乙醇含量的增加，使提取液的極性逐漸與類黃酮的極性接近，從而提高類黃酮的溶出率.乙醇含量較低時，提取液中的糖類和蛋白質(zhì)等水溶性物質(zhì)大量溶出，細(xì)胞內(nèi)部組織的孔道受堵，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞中的類黃酮滲出受阻[16].因此在一定的水平范圍內(nèi)，當(dāng)乙醇含量和提取溫度適當(dāng)提高時，由于二者的協(xié)同作用均可使植物細(xì)胞中類黃酮的提取率明顯提高.但當(dāng)提取溫度過高時，氣泡中的蒸氣壓太高，使氣泡在閉合時增強(qiáng)了緩沖作用導(dǎo)致空化效應(yīng)減弱，且乙醇揮發(fā)量也增加，而乙醇含量過高時，提取液的極性逐漸偏離類黃酮的極性，影響類黃酮的溶出；此外，乙醇含量過高時，雜質(zhì)溶出量增多，易與類黃酮競爭同乙醇結(jié)合，亦導(dǎo)致類黃酮提取率降低[17].因此，當(dāng)提取溫度和乙醇含量過高時，兩因素的交互作用對類黃酮提取率的影響呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)關(guān)系.

由圖3可知，超聲波功率與提取溫度交互作用的等高線呈橢圓形，表明提取溫度與超聲波功率的交互作用在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)對類黃酮提取率的影響顯著(P<0.05).超聲波功率與提取溫度對類黃酮提取率的影響先呈顯著(P<0.05)正相關(guān)交互關(guān)系，當(dāng)超聲波功率高于375 W，提取溫度高于30 ℃時，兩因素對類黃酮提取率的影響呈負(fù)相關(guān)交互關(guān)系.當(dāng)超聲波功率處于低水平時，隨著超聲波功率的增大，反應(yīng)體系的機(jī)械及空化作用增強(qiáng)，分子的擴(kuò)散速度增大[18]，可提高類黃酮的提取率.此外，適當(dāng)提高提取溫度亦有利于植物細(xì)胞中類黃酮的溶出，當(dāng)二者在一定范圍內(nèi)同時增大時，由于協(xié)同作用可使類黃酮提取率提高得更明顯；反之，當(dāng)超聲波功率過高，強(qiáng)烈的空化作用會導(dǎo)致有效提取成分的破壞[19-20]， 而提取溫度過高時會導(dǎo)致乙醇溶劑的揮發(fā)[21]，二者結(jié)合可導(dǎo)致類黃酮提取率下降.因此，在一定范圍內(nèi)增大超聲波功率和提取溫度有助于提高類黃酮的提取率，但超聲波功率和提取溫度過高都會導(dǎo)致類黃酮提取率的下降.

由圖4可知，料液比與乙醇含量交互作用的等高線呈橢圓形，表明乙醇含量與料液比的交互作用在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)對類黃酮提取的影響極顯著(P<0.01).隨著乙醇含量和料液比的增加，類黃酮提取率呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)乙醇含量為72.5%，料液比為1∶35時，類黃酮提取率達(dá)到最大值(15.20%).料液比太小，提取的溶劑量不足會影響類黃酮的溶出；增大料液比有助于類黃酮的提取，且適當(dāng)提高乙醇含量，使提取液的極性逐漸與類黃酮的極性接近，從而促進(jìn)類黃酮的溶出.當(dāng)料液比和乙醇含量同時增大時，二者的協(xié)同作用可使類黃酮提取率提高得更明顯.但當(dāng)料液比達(dá)到一定的比值時，類黃酮已基本溶出，其提取率不再提高；而當(dāng)乙醇含量過高時，提取液的極性逐漸偏離類黃酮的極性，則影響類黃酮的提取率.

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design Expert 7.0軟件求解回歸方程，得到鼠曲草類黃酮提取的最佳工藝條件為：提取溫度34.45 ℃、乙醇含量73.35%、超聲波功率343.5 W、料液比1∶33，在此條件下類黃酮的提取率為15.32%.為便于實(shí)際操作，采用修正的優(yōu)化組合條件，即提取溫度35 ℃、乙醇含量73%、超聲波功率350 W、料液比1∶35.采用修正條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得類黃酮提取率3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值為15.25%，與理論值相對誤差0.46%.經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與同水平理論預(yù)測值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，表明與實(shí)際情況吻合，證明回歸方程是可靠的，因此可用該回歸方程代替真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測.

3結(jié)論與討論

鼠曲草作為藥食兼用的野生資源，在我國大部分地區(qū)均有分布，但目前對該資源的開發(fā)利用有限，尤其對其類黃酮提取方面的研究較少.本試驗(yàn)首次采用Box-Benhnken設(shè)計(jì)優(yōu)化鼠曲草類黃酮超聲波輔助提取工藝，結(jié)果表明該法操作方便、提取率高，且數(shù)據(jù)精確、科學(xué)可行，為鼠曲草資源的綜合利用以及類黃酮產(chǎn)業(yè)化提供可靠依據(jù).

參考文獻(xiàn)

[1] ZENG W C, ZHU R X, JIA L R, et al. Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of essential oil fromGnaphliumaffine[J]. Food and Chemical Toxicology, 2011,49(6):1322-1328.

[2] 王世寬,潘明,任路遙.大有開發(fā)前景的野生蔬菜——鼠曲草[J].食品研究與開發(fā),2005,27(4):95-97.

[3] 成都市衛(wèi)生局.民間常用草藥匯編[M].成都:四川人民出版社,1965:220.

[4] 日華子(五代吳越).日華子本草[M].蕪湖:安徽科學(xué)技術(shù)出版社,1983:10.

[5] 孫群,陸葉,吳雙慶,等.秋鼠曲草化學(xué)成分研究[J].中藥材,2012,35(4):566-568.

[6] DENIS D, SOPHIE G G, AXELLE G, et al. Stable solid-supported leucoanthocyanidin variants for flavanoid biosynthesis elucidation [J]. Tetrahedron Letters, 2009,50(49):6567-6571.

[7] HUMA A, SAVITA D.Invitroantimicrobial activity of flavanoids ofOcimumsanctumwith synergistic effect of their combined form [J]. Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 2012,2(1):396-398.

[8] EKO S, ELLA V, MUSTAQIM A R, et al. Total flavonoid and antioxidant activity of some selected medicinal plants in south Kalimantan of Indonesian [J]. APCBEE Procedia, 2012,3(4):235-239.

[9] 李剛剛.萬壽菊葉黃素及黃酮的提取與優(yōu)化工藝研究[D].甘肅:蘭州大學(xué),2010.

[10] FAN J P, CAO J, ZHANG X Z, et al. Optimization of ionic liquid based ultrasonic assisted extraction of puerarin fromRadixpuerariaeLobatae by response surface methodology [J]. Food Chemistry, 2012,135(4):2299-2306.

[11] 李筱玲,鄧寒霜.黃酮類化合物提取分離方法研究進(jìn)展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,61(1):77-79,92.

[12] AGHAIE E, PAZOUKI M, HOSSEINI M R, et al. Response surface methodology (RSM) analysis of organic acid production for Kaolin beneficiation byAspergillusniger[J]. Chemical, 2009,147(1):245-251.

[13] 郭亞鍵,范莉,王曉強(qiáng),等.關(guān)于NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定總黃酮方法的探討[J].藥物分析雜志,2002,22(2):97-97.

[14] 李志西,杜雙奎.試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析[M].北京:科學(xué)出版社,2010:212-243.

[15] YANG L, LIU Y, ZU Y G, et al. Optimize the process of ionic liquid-based ultrasonic-assisted extraction of aesculin and aesculetin fromCortexfraxiniby response surface methodology [J]. Chemical Engineering Journal, 2011,175(9):539-547.

[16] 陳海光,黃敏,于立梅.超聲波輔助提取青皮竹葉黃酮工藝的研究[J].食品工業(yè)科技,2010,31(9):60-65.

[17] 郭詹睿.洋蔥類黃酮的提取及生物活性研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2010.

[18] 王錚敏.超聲波在植物有效成分提取中的應(yīng)用[J].三明高等專科學(xué)校學(xué)報(bào),2002,19(4):45-47.

[19] 李鳳林,李青旺,馮彩,等.天然黃酮化合物提取方法研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑,2008,5(6):60-65.

[20] 肖揚(yáng),段玉峰.超聲波輔助法提取烏藤黃酮及其抗氧化活性的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2011,15(7):38-41.

[21] 喬東東，張?jiān)?，尤新軍，等．星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化梓樹果實(shí)總黃酮的超聲提取工藝[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25(3)：170-174.

(責(zé)任編輯:施曉棠)

Optimization of ultrasound-assisted extraction of flavonoids fromGnaphliumaffineby Box-Benhnken Design

LIN Huating, Lü Feng, HUANG Guochao

(College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Abstract:A four-factor-five-level Box-Benhnken Design was applied to optimize the parameters of ultrasound-assisted extraction of flavonoids from Gnaphlium affine D.Don. Basing on single factor experiments, extraction temperature, ethanol content, ultrasonic power and solid-liquid ratio were investigated. Results showed that the optimal ultrasound-assisted conditions of flavonoids were as follows: extraction temperature, 35 ℃; ethanol content, 73%; ultrasound power, 350 W; solid-to-liquid ratio, 1∶35. Under this condition and to be extracted for 50 minutes, the maximum extraction rate of flavonoid was 15.25%.

Key words:Gnaphlium affine; flavonoids; ultrasound-assisted extraction; optimization

DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.01.016

中圖分類號:TQ460.6+2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1671-5470(2016)01-0094-07

作者簡介:林華婷(1990-)，女，碩士.研究方向：食品化學(xué)與營養(yǎng).Email：765694310qq.com.通訊作者呂峰(1964-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師.研究方向：功能成分提取與天然產(chǎn)物的綜合利用.Email：yongyi64@163.com.

基金項(xiàng)目:福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012J01081).

收稿日期：2015-03-06修回日期：2015-05-13