宛柏杰, 林文武, 吳錦鴻, 陳曉敏, 吳祖建, 張　潔

(福建農(nóng)林大學植物病毒研究所，福建省植物病毒學重點實驗室，福建 福州 350002)

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水稻矮縮病毒非結構蛋白Pns6和外殼蛋白P8多克隆抗體的制備及其應用

宛柏杰, 林文武, 吳錦鴻, 陳曉敏, 吳祖建, 張潔

(福建農(nóng)林大學植物病毒研究所，福建省植物病毒學重點實驗室，福建 福州 350002)

摘要:利用RT-PCR的方法從感染水稻矮縮病毒(Rice dwarf virus, RDV)的水稻中克隆該病毒的運動蛋白基因S6和外殼蛋白基因S8，通過Gateway系統(tǒng)進行原核表達，獲得表達載體pDEST17-Pns6和pDEST17-P8，將表達載體轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta，經(jīng)IPTG誘導表達后獲得分子質(zhì)量約為59和46 ku含HIS標簽的融合蛋白.以誘導表達的目的蛋白為抗原，免疫注射新西蘭大白兔制備多克隆抗體.結果表明，Western blot檢測制備的Pns6和P8抗體可特異性檢測RDV，間接ELISA測定Pns6和P8抗體的效價均約為6400倍，并建立了可靠、靈敏、特異的Dot-blot ELISA方法檢測RDV.以上研究表明，RDV運動蛋白和外殼蛋白抗體均可應用于該病毒在田間的大規(guī)模調(diào)查和檢測.

關鍵詞:水稻矮縮病毒; 非結構蛋白Pns6; 外殼蛋白P8; 多克隆抗體; Dot-blot ELISA

水稻矮縮病毒(Ricedwarfvirus,RDV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)的成員之一[1].1883年首次在日本被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)分布于中國、日本、朝鮮、菲律賓、尼泊爾等東南亞水稻產(chǎn)區(qū).在自然條件下，RDV由黑尾葉蟬(Nephotettixcincticeps)或電光葉蟬(Recilimadorsal)以持久性方式經(jīng)卵傳播[2].該病害為系統(tǒng)性侵染病害，植株感病后，所有分蘗均能發(fā)病，植株癥狀表現(xiàn)為顯著矮縮，分蘗增多，葉色濃綠，葉片粗而僵直，沿葉脈出現(xiàn)白色虛線狀斑點[3].2011年以來，該病害在我國南方稻區(qū)的浙江、江蘇、安徽、福建等省普遍發(fā)生，并有逐年加重的趨勢.因此，在水稻矮縮病毒發(fā)病早期進行監(jiān)控和診斷，可以有效的減少稻田的損失.目前國內(nèi)外用于檢測植物病毒的方法主要包括RT-PCR、免疫學檢測、電子顯微鏡觀察、IC-RT-PCR、免疫電鏡等方法.用RT-PCR和IC-RT-PCR的方法來檢測水稻病毒，其特異性和敏感性都非常的高，但是花費的費用較高不適用于田間的檢測預報；利用電鏡和免疫電鏡技術可以直觀的看到病毒粒子，但是需要專業(yè)的技術人員和特殊的儀器；然而，免疫學檢測方法具有特異性強、敏感性高、操作簡便快速，不需要特殊設備條件的特點，可適用于田間病毒的大規(guī)模調(diào)查和快速檢測[4].

RDV全基因組由12條雙鏈RNA(double strand RNA, dsRNA)組成，編碼7個結構蛋白(P1, P2, P3, P5, P7, P8 and P9)和5個非結構蛋白(Pns4, Pns6, Pns10, Pns11 and Pns12)[5-9].其中，Pns6含有類似于依賴ATP的RNA解旋酶的保守模式，其功能可能參與病毒的細胞間運動[10].P8在植物呼腸孤病毒第一亞組中高度保守,并且可以和RGDV外殼蛋白及核心顆粒進行體外異源重構并形成穩(wěn)定的病毒粒子[11].特異性抗血清的制備是免疫學檢測的基礎，而抗原的質(zhì)量決定了抗血清的特異性，目前為止，主要的抗原包括純化的病毒粒子、表達病毒的外殼蛋白和人工合成的多肽[12].由于分離純化RDV病毒容易丟失一些主要成分，人工合成多肽獲得的抗血清特異性較差，因此，本研究對RDV的Pns6和P8進行原核誘導表達，制備了特異性多抗血清，并建立檢測RDV的Dot-blot ELISA的方法，為該病毒的田間檢測及預防提供了技術支持.

1材料與方法

1.1材料

1.1.1RDV水稻毒株與黑尾葉蟬RDV病毒采自福建省福州市郊區(qū)有明顯水稻矮縮病癥狀的水稻病樣，并在本實驗室水稻毒株圃種植保存.黑尾葉蟬采自福州郊區(qū)，于實驗室養(yǎng)蟲室中飼養(yǎng).

1.1.2酶及生化試劑Gateway BP Clonase Enzyme Mix、LR Clonase Enzyme Mix購自Invitrogen公司；總RNA提取試劑Trizol、PCR凝膠回收試劑盒以及質(zhì)粒提取試劑盒購自Omega公司；蛋白marker購自GeneStar公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；6×His單克隆抗體、IPTG、堿性磷酸酶標記的羊抗兔、BCIP/NBT購自Sigma公司；硝酸纖維素膜購自Amersham Pharmacia；Taq DNA聚合酶(含染料)購自北京康為世紀公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純.

1.1.3載體與菌株入門載體pDONR221、原核表達載體pDEST17由魏太云教授饋贈，大腸桿菌DH5α以及Rosetta菌株為本實驗室保存.

1.2方法

1.2.1Pns6和P8基因的克隆和原核表達載體的構建根據(jù)GenBank中已登錄的基因序列(M91653和D13773)設計引物進行PCR擴增，RDV-Pns6-F:5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGACACAGAAACTCTTTGC3′/RDV-Pns6-R:5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTTGTACACGGTAATAGCAAGTAG3′和RDV-P8-F:5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCACGCCAGATGTGGTTAG3′/RDV-P8-R:5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCATTTGGTCGATAGTATCTTCCA3′(下劃線標記的為Gateway重組位點).

Trizol法提取感染RDV病毒的水稻病葉的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA.以cDNA為模板并利用高保真酶進行PCR擴增，將得到的目的片段進行回收，回收產(chǎn)物與入門載體pDONR221在25 ℃條件下進行BP反應，得到的重組質(zhì)粒pDONR221-Pns6和pDONR221-P8送華大基因公司測序，測序正確的質(zhì)粒與表達載體pDEST17在25 ℃條件下進行LR重組反應，獲得表達載體pDEST17-Pns6和pDEST17-P8.

1.2.2Pns6和P8重組蛋白的表達、純化及融合蛋白鑒定分別將表達載體pDEST17-Pns6、pDEST17-P8轉(zhuǎn)入Rosetta菌中，經(jīng)PCR篩選正確的菌液接種于含Amp和Chl抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至D600 nm0.4~0.6，加入IPTG，使其終濃度為1 mmol·L-1.在37 ℃下繼續(xù)誘導表達4h后，吸取1mL菌液于12000 r·min-1離心1 min，得到的菌體用80 μL的無菌水重懸，加入20 μL的5×SDS Loading buffer，沸水中煮5 min后置于冰上使其冷卻，再12000 r·min-1離心5 min.分別取10 μL上清液進行10% SDS-PAGE電泳分析.少量誘導成功后，進行大量誘導.通過超聲波破碎儀器破碎菌體，對蛋白的可溶性進行分析，同時得到較為純化的蛋白.利用6×His單克隆抗體參照Wu et al[13]的方法對純化的融合蛋白進行Western blot分析.

1.2.3Pns6和P8重組蛋白的多抗血清的制備大量誘導的目的蛋白進行SDS-PAGE電泳后，用預冷的KCl(0.1 mol·L-1)溶液染色2 min，可見乳白色條帶.根據(jù)目的條帶的大小割下白色條帶，用生理鹽水與等量弗氏佐劑進行充分研磨，得到的乳狀液體作為免疫抗原，參考歐陽元龍等[14]方法注射新西蘭大白兔，注射5次后動脈取血，并采用趙芹等[15]方法獲得抗血清，分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.4多克隆抗體的特異性檢測及效價分析參照林林等[16]方法，提取健康水稻和感病水稻的總蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后通過半干轉(zhuǎn)印法(電流 200 mA，時間 90 min)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，經(jīng)含5%脫脂奶粉的PBST封閉液于37 ℃搖床封閉1 h后，用PBST洗3遍，每次5 min.將PVDF膜置于1∶1000稀釋的Pns6和P8抗血清中37 ℃孵育1 h.再用PBST洗3遍后，放入1∶20000稀釋的anti-rabbit IgG-AP抗體中37 ℃孵育1 h.將PVDF膜用PBST洗3遍后放入BCIP/NBT顯色液中避光顯色，待顏色顯現(xiàn)出來，取出PVDF膜，用去離子水終止反應.參考Wu et al[13]的方法，利用間接ELISA的方法測定抗體效價.

1.2.5Dot-blot ELISA檢測RDV方法的建立取待檢測樣品用液氮研磨后，將提取的蛋白樣品3 μL點到硝酸纖維素膜上晾干.將NC膜浸入封閉液(含5%脫脂奶粉的PBST)中37 ℃下封閉1 h，取出NC膜，用含0.05% PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min；分別放入Pns6、P8免疫抗體(抗體稀釋液1∶3000倍稀釋)中37 ℃下孵育1 h；用PBST洗3遍，每次5 min；將膜放入用封閉緩沖液稀釋的堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG二抗(1∶10000稀釋)中37 ℃下孵育1 h；PBST洗滌3次后在NBT/BCIP顯色底物中充分顯色，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時，用雙蒸水終止反應并記錄檢測結果.

2結果與分析

2.1Pns6和P8基因的克隆和原核表達載體的構建

通過RT-PCR從RDV感病水稻中擴增獲得Pns6(1530 bp)和P8(1266 bp)基因的目的片段，再進行BP反應重組獲得入門載體pDONR221-Pns6、pDONR221-P8.重組質(zhì)粒測序結果顯示：克隆的Pns6和P8基因與日本株具有高度同源性，并且讀碼框正確，可以用于后續(xù)的原核表達.通過LR反應及PCR驗證得到表達載體pDEST17-Pns6、pDEST17-P8(圖1).

2.2重組蛋白的表達、純化及融合蛋白的鑒定

將重組載體pDEST17-Pns6和pDEST17-P8分別轉(zhuǎn)化到表達菌株E.coliRosetta中，篩選出陽性克隆于液體LB培養(yǎng)基中37 ℃，250 r·min-1震蕩培養(yǎng).經(jīng)1 mmol·L-1IPTG誘導表達后進行SDS-PAGE電泳檢測，在約59和46 ku處出現(xiàn)與預測融合蛋白大小一致的條帶(圖2)，經(jīng)超聲波破碎發(fā)現(xiàn)，兩者皆存在于沉淀中，均為不可溶蛋白(圖3A、B).進一步利用6×His標簽單克隆抗體進行Western blot分析發(fā)現(xiàn)，表達的重組蛋白均能與6×His單克隆抗體起特異性反應(圖3C)，表明Pns6和P8蛋白已經(jīng)在E.coliRosetta中正確融合表達.

2.3多克隆抗體的特異性和效價分析

提取健康水稻及感病水稻中的總蛋白，以獲得的Pns6和P8抗體為一抗，進行Western blot分析.結果顯示Pns6和P8抗體可以特異性結合病株提取液中的一條56和43 ku條帶，而在健康水稻的提取液沒有檢測到任何條帶(圖4)，說明制備的抗血清具有很好的特異性.進一步采用間接ELISA法測定效價，以免疫前的兔血清為陰性對照，進行梯度稀釋，結果表明，Pns6和P8抗體分別在稀釋6400倍的情況下，陽性對照比陰性對照值仍有2倍以上關系，表明Pns6和P8抗體效價都為6400倍.

2.4Dot-blot ELISA 檢測RDV方法的建立

將感染RDV的水稻、帶毒葉蟬、水稻齒葉矮縮病毒(RRSV)，南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)、健康水稻和無毒葉蟬提取液各3 μL分別點到硝酸纖維素膜上，重復2次，室溫干燥、封閉后用封閉緩沖液稀釋的多抗血清作為一抗(1∶500稀釋)進行Dot-blot ELISA檢測.結果顯示，多抗血清只能與感染RDV的水稻和葉蟬發(fā)生反應產(chǎn)生特異性斑點，與RRSV、SRBSDV、健康水稻和無毒葉蟬提取液都沒有任何反應,且Pns6、P8抗體顯色結果一致.結果表明，該Dot-blot ELISA方法可以很好地用于水稻矮縮病的大量檢測.

3討論

水稻矮縮病是水稻上的一種嚴重病害，目前還沒有有效的控制措施，因此，主要依靠發(fā)病早期對病害進行監(jiān)控和診斷，并根據(jù)診斷結果提供有效的防治策略.本研究基于免疫學的檢測方法，建立了一種Dot-blot ELISA檢測方法.與傳統(tǒng)檢測水稻病毒RT-PCR和IC-RT-PCR的方法相比，本文建立的Dot-blot ELISA檢測體系具有很高的準確性，同時又由于其操作簡便且不需要復雜的儀器，克服了RT-PCR和IC-RT-PCR不易推廣的不足之處，更適用于基層樣品的大量檢測，為田間病毒病害的鑒定及預測預報奠定了基礎.

本研究通過在大腸桿菌里表達融合6×His的重組蛋白來制備抗體，克服了提純病毒不純的困難.此外，融合表達的蛋白不含有寄主植物的成分，以此產(chǎn)生的抗體特異性強，用血清學方法檢測時不易出現(xiàn)假陽性，這為檢測和研究病毒提供了有利條件[17].近年來通過將水稻病毒基因進行原核表達，來獲得目的基因抗體的方法也得到了廣泛的應用[18-19].通過對RDV編碼的7個結構蛋白和5個非結構蛋白功能進行分析，選取了參與病毒在寄主中運動的非結構蛋白Pns6和病毒復制的主要外殼蛋白P8，作為病毒檢測的靶標.與RDV其他功能蛋白相比，Pns6和P8蛋白在寄主體內(nèi)的表達量較高，而在寄主感病早期病毒量相對較少，所以Pns6和P8蛋白是檢測病毒的理想靶標.綜上所述，本研究獲得的抗血清可以很好的用于RDV的血清學檢測，同時也為進一步研究蛋白在介體葉蟬及在水稻細胞中的定位及其功能奠定基礎.

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(責任編輯:吳顯達)

Preparation and application of polyclonalantibodies against non-structural protein Pns6 and coat protein P8 of Rice dwarf virus

WAN Baijie, LIN Wenwu, WU Jinhong, CHEN Xiaomin, WU Zujian, ZHANG Jie

(Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University, Key Laboratory of Plant Virology of Fujian Province, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Abstract:A full length cDNA of Rice dwarf virus (RDV) segment S6 encoding movement protein and segment S8 encoding coat protein were cloned from infected rice samples by RT-PCR. Vectors of pDEST17-Pns6 and pDEST17-P8 were expressed via Gateaway system and followed by being transformed into E.coli Rosetta. Then the 59 and 46 ku HIS-tag fusion protein, obtained with the induction of IPTG from E.coli Rosetta cells, were used to immunize New Zealand Rabbits as an antigen for polyclonal antibodies production. Both Western blot and ELISA method proved that both antibodies could detect infected rice plants specifically, indirect ELISA method detection of antiserum titer of Pns6 and P8 were 6400 times. To summarize, Dot-blot ELISA was established for reliable, sensitive and specificfor RDV detection. Both antibodies against non-structural protein and coat protein of Rice dwarf virus could be applied to fast virus detection at field-scale.

Key words:Rice dwarf virus; non-structural protein Pns6; coat protein P8; polyclonal antibodies; Dot-blot ELISA

DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.01.008

中圖分類號:S435.111.4+9

文獻標識碼:A

文章編號:1671-5470(2016)01-0042-06

作者簡介:宛柏杰(1991-)，男，碩士研究生.研究方向：分子植物病毒學.Email:1094830730@qq.com.通訊作者張潔(1983-)，女，講師.研究方向：分子植物病毒學.Email:jiezhang3553@163.com.

基金項目:高等學校博士學科點專項科研基金(新教師類)(20133515120004)；國家自然科學基金(31301640)；福建省教育廳科技項目(JA13103).

收稿日期：2015-04-14修回日期：2015-05-20