駱米娟, 張賀賀, 陳家驊, 杜迎剛, 何龍艷， 季清娥

(1.福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建 福州 350002；2.濰坊科技學院，山東 壽光 262700)

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南亞實蠅成蟲腸道細菌的分離與鑒定

駱米娟1, 張賀賀1, 陳家驊1, 杜迎剛2, 何龍艷1， 季清娥1

(1.福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建 福州 350002；2.濰坊科技學院，山東 壽光 262700)

摘要:采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)和16S rDNA (V6-V8)高變區(qū)測序相結合的方法，從室內(nèi)人工飼養(yǎng)的性成熟南亞實蠅雌蟲腸道中分離、鑒定出21株細菌，均屬于γ-變形菌門，分別為腸桿菌屬(7株)、拉烏爾菌屬(3株)、沙雷氏菌屬(2株)、普羅維登斯菌屬(2株)、不動桿菌屬(1株)、檸檬酸桿菌屬(1株)、西地西菌屬(1株)和不可培養(yǎng)的細菌(4株)；從性成熟的南亞實蠅雄蟲腸道內(nèi)分離得到20株細菌，分別為細菌(7株)、克雷伯氏菌屬(4株)、腸桿菌屬(3株)、普羅維登斯菌屬(2株)、沙雷氏菌屬(1株)、摩根菌屬(1株)、假單胞菌屬(1株)和γ-變形桿菌(1株)，也均屬于γ-變形菌門.由上可知，性成熟的南亞實蠅雌、雄成蟲腸道共有細菌為腸桿菌屬、普羅維登斯菌屬和沙雷氏菌屬，均屬于腸桿菌科，表明腸桿菌科是南亞雌、雄成蟲腸道細菌的優(yōu)勢菌群.

關鍵詞:南亞實蠅; 腸道; 細菌; 腸桿菌科

南亞實蠅Bactroceratau(Walker)，亦稱南亞寡鬃實蠅，俗稱南瓜實蠅，屬雙翅目(Diptera)實蠅科(Trypetidae)果實蠅屬(Bactrocera)，是一種食性較廣的世界性檢疫害蟲[1]，嚴重危害絲瓜、南瓜、黃瓜等13種瓜類蔬菜和柑橘類、芒果、番石榴等70多種水果，給果蔬生產(chǎn)及貿(mào)易造成巨大的經(jīng)濟損失[2].目前，國內(nèi)外對南亞實蠅的研究主要集中在生物學、生理學、生態(tài)學和綜合防治[3-8]以及類群分化、系統(tǒng)發(fā)育和種的分子鑒定等幾個方面[9-10]，而對南亞實蠅腸道微生物鮮有報道.

昆蟲腸道中微生物種類繁多，昆蟲在進化過程中，與腸道微生物相互合作、相互影響、協(xié)同進化，形成了不可分割的共生關系[11].腸道微生物在許多方面影響宿主昆蟲的生理活動，如提供營養(yǎng)、協(xié)助抵抗外來天敵捕食及微生物侵染、解毒以及引起宿主免疫反應等[12-15]，同時宿主昆蟲為腸道細菌群落的代謝活動提供微生態(tài)環(huán)境.

隨著微生態(tài)學技術的日趨完善以及測序技術和分子生物學技術的進步，昆蟲腸道細菌群落結構和腸道微生態(tài)系統(tǒng)的研究日益深入，取得了更為豐富的群落結構信息，但若想用生物學試驗證明腸道微生物對宿主的作用，仍然需要借助傳統(tǒng)的微生物學純培養(yǎng)方法獲得菌株材料.本文運用傳統(tǒng)微生物分離和16S rRNA基因技術相結合的方法，分離、培養(yǎng)、鑒定了性成熟的南亞實蠅雌、雄成蟲腸道細菌，并分析其群落結構，以期為進一步探討南亞實蠅成蟲腸道菌的功能及其生物防治提供技術支持和菌種儲備.

1材料與方法

1.1供試蟲源

供試性成熟的南亞實蠅雌、雄成蟲來自福建農(nóng)林大學益蟲研究所，已在所內(nèi)人工繁育23代.養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度(25±2) ℃、相對濕度65%±5%、光周期為L∶D=14∶10.

1.2成蟲腸道解剖

隨機選取實驗室飼養(yǎng)的性成熟的南亞實蠅雌、雄成蟲各30頭，置于加有PBS緩沖液的離心管中浸泡1 min，倒掉PBS緩沖液，重復1次，再用75%酒精沖洗2次，每次2 min，倒掉酒精.在超凈工作臺內(nèi)取出蟲體并用無菌水漂洗3次，然后在加有無菌蒸餾水的培養(yǎng)皿中將其解剖.將腸道內(nèi)含物研磨、溶解于1 mL無菌水中混勻備用.

1.3成蟲腸道菌的分離與純化

將上述提取的腸道內(nèi)容物按照10-5、10-6、10-7進行梯度稀釋，取200 μL稀釋菌液，用無菌涂布棒分別均勻涂布于LB、NA平板培養(yǎng)基上，靜置5~10 min；將上述稀釋平板置于37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置培養(yǎng)1~2 d.用接種環(huán)挑取生長較好、顏色及形態(tài)不同、菌落較大的單菌落，在LB平板上進行數(shù)次三區(qū)劃線分離，直到得到單一的純菌落.將純化后得到的菌株于NA斜面上置于4 ℃冰箱內(nèi)保藏備用.所有操作均在無菌條件下進行.

1.416S rRNA基因擴增

在無菌條件下，用接種環(huán)分別挑取NA斜面上的菌株，接入1 mL經(jīng)高壓滅過菌的NB培養(yǎng)基中，然后在37 ℃、180 r·min-1的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng).采用菌液PCR的方法，用16S rDNA的通用引物968GC(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC)和L1401(CGGTGTGTACAAGACCC)對V6-V8區(qū)間片段進行擴增.PCR反應體系(30 μL)：10×PCR bufferⅡ(with Mg2+) 3.0 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，968GC和L1401各0.5 μL，菌液1 μL，TaKaRa LaTaq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，ddH2O 24.0 μL.PCR反應條件：95 ℃預變性5 min、94 ℃ 變性30 s、56 ℃ 退火30 s、72 ℃ 復性1 min，共30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫.分別取3 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，觀察有無500 bp左右的條帶，陰性對照為不加DNA模板的反應體系，以檢測樣品是否被污染.檢測后的PCR產(chǎn)物送上海鉑尚生物技術有限公司測序，所用測序儀為ABI 3730 XL，測序引物為968GC和L1401.

1.5系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫選取各個菌株的近緣序列，利用Clustal X軟件對測序獲得的16S rRNA基因序列和與之近緣的已知序列進行多序列比對，利用MEGA 5.0軟件的鄰位相連算法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設定為1 000.

2結果與分析

2.1腸道內(nèi)分離的可培養(yǎng)菌及16S rDNA擴增結果

從性成熟的南亞實蠅雌成蟲腸道得到78株單菌株，雄蟲腸道得到48株單菌株，分別以這126株單菌株的菌液為模板擴增16S rRNA基因，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，獲得的細菌16S rDNA片段大小在500 bp左右，是試驗所需的目的片段(圖1).

2.2單菌株16S rDNA序列分析結果

經(jīng)PCR擴增產(chǎn)物并測序得到41條不同序列，其中21條來自南亞實蠅的雌性腸道，20條來自雄性腸道.將所測得的序列提交NCBI進行blast同源性比對發(fā)現(xiàn),在所分離得到的細菌中,與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知16S rDNA序列相似性最高的為100%，最低的為97%；其中，40種細菌與已知序列相似性高于98%，1種細菌與已知序列相似性低于98%(表1).一般認為，16S rDNA序列同源性>99%，屬于同一種；16S rDNA序列同源性<98%，屬于不同的種[16].

比對結果表明,從南亞實蠅雌成蟲腸道分離的21株細菌均屬于γ-變形菌門(Gamma-proteobacteria).其中,4株[BF(6)、BF(28)、BF(31)和BF33]為不可培養(yǎng)的細菌(uncultured bacterium)，7株[BF(12)、BF(20)、BF(27)、BF(32)、BF16、BF18和BF23]屬于腸桿菌屬(Enterobacter)，3株[BF(33)、BF8和BF32]屬于拉烏爾菌屬(Raoultella)，2株[BF(1)和BF(18)]屬于沙雷氏菌屬(Serratia)，2株[BF(7)和BF(29)]屬于普羅維登斯菌屬(Providencia)；BF31屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)，BF(17)屬于檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)，BF(34)屬于西地西菌屬(Cedecea).可見，腸桿菌屬為優(yōu)勢菌.

從南亞實蠅雄成蟲腸道分離的20株細菌也均屬于γ-變形菌門.其中,7株(BM4、BM7、BM15、BM34、BM35、BM40和BM43)為uncultured bacterium/bacterium，4株(BM1、BM14、BM21和BM26)屬于克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，3株(BM6、BM8和BM33)屬于腸桿菌屬，2株(BM29和BM41)屬于普羅維登斯菌屬，1株(BM12)屬于沙雷氏菌屬，1株(BM30)屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)，1株(BM36)屬于摩根菌屬(Morganella)，1株(BM2)屬于γ-變形桿菌(gamma Proteobacterium).可見，克雷伯氏菌屬為優(yōu)勢菌.

由上可知，南亞實蠅雌、雄成蟲腸道的共有細菌為腸桿菌屬、沙雷氏菌屬和普羅維登斯菌屬.

表1　南亞實蠅成蟲腸道細菌16S rDNA序列的blast比對結果1)

1)BF.南亞實蠅雌性成蟲;BM.南亞實蠅雄性成蟲.

2.3腸道菌系統(tǒng)發(fā)育分析

對測序得到的南亞實蠅性成熟雌、雄成蟲的腸道細菌16S rDNA序列進行系統(tǒng)進化分析，結果見圖2~3.南亞實蠅雌成蟲腸道細菌可以歸入7個屬(Enterobacter、Serratia、Providencia、Cedecea、Citrobacter、Raoultella以及Acinetobacter)，分別在進化樹上形成了獨立的分支，且這7個屬形成了一個以γ-變形菌門為家族的大分支(圖2).南亞實蠅雄成蟲腸道細菌可以歸入6個屬，且這6個屬形成了一個以γ-變形菌門為家族的大分支(圖3).這表明從南亞實蠅性成熟的雌、雄成蟲腸道分離的所有細菌均為γ-變形菌門.

3結論與討論

本研究采用傳統(tǒng)微生物分離純培養(yǎng)與16S rDNA技術相結合的方法分析了南亞實蠅性成熟的雌、雄成蟲腸道菌的群落結構組成，從雌蟲腸道中分離出21株細菌，分別屬于Enterobacter、Serratia、Providencia、Raoultella、Acinetobacter、Citrobacter及Cedecea7個屬；從雄蟲腸道中分離出20株細菌，分別屬于Klebsiella、Enterobacter、Providencia、Serratia、Morganella及Pseudomonas6個屬.雌、雄成蟲腸道共有的細菌為Enterobacter、Serratia及Providencia，而Enterobacter、Serratia、Raoultella、Providencia、Acinetobacter、Citrobacter、Cedecea、Klebsiella、Pseudomonas及Morganella均屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細菌.

系統(tǒng)進化分析表明，從南亞實蠅性成熟的雌、雄成蟲腸道分離的41株細菌均屬于γ-變形菌門.其中，腸桿菌科的細菌為優(yōu)勢菌群.這與國內(nèi)外許多研究者認為的腸桿菌科是雙翅目昆蟲中最普遍的共生微生物[17]相一致.

王莉莉[18]從橘小實蠅(Bactroceradorsalis)雌性生殖系統(tǒng)中分離出的腸桿菌科細菌主要有Morganella、Kluyvera、Citrobacter、Raoultella及Enterobacter；本研究從南亞實蠅雌性成蟲腸道中也分離出了Citrobacter、Raoultella及Enterobacter，說明這些菌可能是雌性實蠅共有屬，與寄生部位無關.本研究從南亞實蠅雄性成蟲腸道分離到了Morganella，而此前無Morganella的報道，這可能是由腸道與生殖系統(tǒng)結構存在差異所導致，有待進一步研究.另外，王洪秀[19]從橘小實蠅3個種群的腸道中均分離出腸桿菌科細菌，如Klebsiella、Citrobacter、Enterobacter及Serratia，這些菌在本研究中也被分離得到.Kuzina et al[20]利用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術從墨西哥實蠅(Anastrephaludens)的消化道內(nèi)分離了大量的腸桿菌科菌群，主要屬于Citrobacter，該屬在本研究中也被分離得到.本研究還從南亞實蠅雌蟲腸道中分離出了1株腸桿菌科的西地西菌屬(Cedecea)細菌，此前未看到有關此類菌的報道，有待于進一步研究.綜上可知，腸桿菌科的細菌普遍存在于實蠅體內(nèi).

Lyudmila et al[17]在墨西哥實蠅體內(nèi)除了分離到腸桿菌科的細菌，還分離到假單胞菌科(Pseudomonadaceae)的細菌.有研究證明,假單胞菌屬(Pseudomonas)的細菌具有抵抗病原真菌的作用，可以保護寄主免受真菌的侵害[21]；本研究也從南亞實蠅雄性成蟲腸道分離到了1株Pseudomonas的細菌，對于此類菌的功能有待于進一步研究.

總體來看，從南亞實蠅雌、雄成蟲腸道中分離到的科的種類較少，其原因可能是腸道結構不同，也可能是受培養(yǎng)基以及分離條件的限制，后續(xù)研究中可以通過增加培養(yǎng)基的種類、優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，分離出更多的細菌種屬.此外，本研究分離出的細菌在腸道中的作用以及對寄主(如產(chǎn)卵、吸引及壽命)的影響有待于進一步研究.

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(責任編輯:楊郁霞)

Isolation and identification of bacteria in the intestinal tract of adultBactroceratau(Walker) (Diptera: Tephritidae)

LUO Mijuan1, ZHANG Hehe1, CHEN Jiahua1, DU Yinggang2, HE Longyan1, JI Qing′e1

(1.College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China；2.Weifang University of Science and Technology, Shouguang, Shandong 262700, China)

Abstract:21 strains of bacteria were isolated and identified from the intestinal tract of sexually matured female Bactrocera tau which were reared in the laboratory using traditional isolation and 16S rDNA (V6-V8 hypervariable region) sequencing technique. All bacteria strains belonged to the Gamma-proteobacteria phylum, which included Enterobacter (7 strains)， Raoultella (3 strains)， Serratia (2 strains)， Providencia (2 strains)， Acinetobacter (1 strain)， Citrobacter (1 strain)， Cedecea (1 strain) and uncultured bacteria (4 strains)． Similarly, 20 bacteria strains were isolated and identified from male B.tau and they also belonged to Gamma-proteobacteria phylum, which consisted of bacteria (7 strains)， Klebsiella (4 strains)， Enterobacter (3 strains)， Providencia (2 strains)， Serratia (1 strain )， Morganella (1 strain)， Pseudomonas (1 strain ) and gamma Proteobacterium (1 strain)． Bacteria genus which both females and males had in common were Enterobacter， Providencia and Serratia, which all belonged to Enterobacteriaceae． To summarize, Enterobacteriaceae was the dominant bacterium in intestinal tract of B.tau．

Key words:Bactrocera tau; intestinal tract; bacterium; Enterobacteriaceae

DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.01.002

中圖分類號:Q939.1; S435

文獻標識碼:A

文章編號:1671-5470(2016)01-0008-06

作者簡介:駱米娟(1989-),女,碩士研究生.研究方向:昆蟲生態(tài)與害蟲綜合治理.Email:mijuanluo@163.com.通訊作者季清娥(1968-),女,研究員.研究方向:農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治.Email:707660390@qq.com.

基金項目:國家自然科學基金項目(11175046).

收稿日期：2015-05-11修回日期：2015-09-14