陳建華，李曉曼，楊文鈺，劉 江*

1農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室；2四川省作物帶狀復(fù)合種植工程技術(shù)研究中心；3四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，成都 611130

果蔬、豆類和茶葉中富含類黃酮[1]，因其具有抗抑郁[2]、抗炎、抗過敏、抗糖尿病、抗衰老[3]和抗癌[4]等多種藥用功能而備受關(guān)注[5]。類黃酮結(jié)構(gòu)與其生物功能密切相關(guān)，O-甲基化類黃酮是含有OCH3基團(tuán)的類黃酮，其在植物根瘤固氮[6,7]、吸引昆蟲傳粉[8,9]等生長發(fā)育進(jìn)程及抗蟲、抗病[10]、抗雜草[11]等抗逆[12,13]反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。研究證實，O-甲基化類黃酮具有更強(qiáng)的抗氧化[14]、抗炎[15]、抗癌[16]等功能，且具有更高的生物利用度[17,18]，更具藥用價值。類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶(FOMT)屬于O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)亞家族，催化類黃酮合成O-甲基化類黃酮，在植物中廣泛存在。本文綜述了O-甲基化類黃酮結(jié)構(gòu)與功能，及OCH3基團(tuán)對其功能的影響；整理歸納了FOMT研究現(xiàn)狀，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，以期為O-甲基化類黃酮及FOMT的進(jìn)一步的研究與應(yīng)用開發(fā)提供參考。

1 O-甲基化類黃酮結(jié)構(gòu)

類黃酮是重要的植物次生代謝產(chǎn)物，在植物中存在超過10 000種類黃酮[19]，其基本結(jié)構(gòu)為C6-C3-C4，是一類2-苯基色原酮類化合物，由兩個芳環(huán)(A和B)，通過含氧雜環(huán)(環(huán)C)連接形成。其合成起始于丙二酰輔酶A和4-香豆酸輔酶A[20]，與木質(zhì)素具有共同的合成前體，也有一些特殊的類黃酮的合成起始于輔酶A，如肉桂酸和二羥基香豆酸。類黃酮亞組包括：黃酮、黃酮醇、黃烷酮、黃烷醇、異黃酮、花色素等。修飾反應(yīng)導(dǎo)致了類黃酮化合物結(jié)構(gòu)與功能的多樣性[21]，基本的修飾反應(yīng)包括：酰基化、糖基化、羥基化、異戊烯基化、甲基化等。甲基化是類黃酮重要的修飾反應(yīng)，包括C-甲基化和O-甲基化兩類，O-甲基化的類黃酮在植物中廣泛存在，而C-甲基化的類黃酮存在于少數(shù)植物中，例如無刺藤[22]。O-甲基化修飾是一種常見的化學(xué)修飾，在類黃酮的不同位點都會發(fā)生；類黃酮經(jīng)不同位點與不同數(shù)量的O-甲基化修飾，產(chǎn)生不同的O-甲基化類黃酮，常見的類(異)黃酮如表1和2所示，其結(jié)構(gòu)骨架分別見圖1和2。由表可知，植物類黃酮的O-甲基化修飾在A環(huán)和B環(huán)上均會發(fā)生，且多發(fā)生于B環(huán)的3′和4′號羥基位點和A環(huán)的6、7、8號羥基位點(其中，A環(huán)以7號位點修飾居多)；而已見報道的植物異黃酮O-甲基化修飾多發(fā)生于B環(huán)的4′號羥基位點，極少數(shù)發(fā)生于A環(huán)的7號羥基位點。不同物種的植物類黃酮O-甲基化修飾位點不同，其中，大豆、苜蓿等雙子葉植物類黃酮的O-甲基化修飾多發(fā)生于3′和4′號羥基位點，而水稻等單子葉植物多發(fā)生于3′、5′、7號羥基位點。

圖1 類黃酮骨架Fig.1 Flavonoid skeleton

表1 常見類黃酮結(jié)構(gòu)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

圖2 異黃酮骨架Fig.2 Flavonoid skeleton

表2 常見異黃酮結(jié)構(gòu)

2 O-甲基化修飾對類黃酮功能的影響

2.1 O-甲基化類黃酮藥用功能

諸多研究表明，O-甲基化類黃酮具有多種藥用功能，且O-甲基化修飾可提高部分類黃酮的藥用活性。C-8位的O-甲基化修飾可增強(qiáng)類黃酮促胰島素分泌活性，從而提高抗糖尿病功能[23]。O-甲基化修飾還能提高類黃酮抑制糖尿病并發(fā)癥的能力[24,25]，蛋白質(zhì)糖化形成晚期糖基化終產(chǎn)物AGEs(advanced glycation end products)[26]，引起糖尿病并發(fā)癥，染料木素可抑制蛋白糖化，而C-7位和C-4′位O-甲基化的染料木素抑制能力更強(qiáng)[27]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)誘導(dǎo)各種腫瘤細(xì)胞凋亡，O-甲基類黃酮(5,7-dimethoxyflavone、5,7,4′-trimethoxyflavone、3,5,7,3′,4′-pentamethoxyflavone)可通過死亡受體和線粒體途徑，增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的人白血病MOLT-4細(xì)胞凋亡[28]。刺芒柄花素(C-4′位O-甲基化)可抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞[29]，其還能通過G0/G1期阻滯抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)ES2和OV90卵巢癌細(xì)胞的凋亡[30]。5，7，4′-三甲氧基黃酮對SCC-9人舌鱗癌細(xì)胞抑制效力，是5，7，4′-三羥基黃酮(芹菜素)的8倍，其IC50值分別為5 μM與40 μM[31]。O-甲基化修飾提高類黃酮的抗氧化活性，提高抗炎能力。異鼠李素是一種3′-O-甲基化槲皮素，能抑制促炎物質(zhì)分泌，降低活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量，具有強(qiáng)抗氧化作用[32]。在應(yīng)對關(guān)節(jié)炎時，橙皮素具有鎮(zhèn)痛與抗炎的功效[15]。O-甲基化類黃酮可影響多藥耐藥蛋白活性，提高機(jī)體防御有毒化合物的能力[33]。

2.2 O-甲基化修飾提高類黃酮藥用價值的機(jī)理

研究表明，O-甲基化修飾可提高類黃酮的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、蛋白親和力、轉(zhuǎn)運力，降低其水溶性，這些性質(zhì)的改變是其藥用價值提升的關(guān)鍵。生物利用度是指制劑中藥物被吸收進(jìn)入人體循環(huán)的速度與程度，它反映了化合物在生物體內(nèi)吸收，分布，代謝和排泄的情況[34]。類黃酮的低生物利用度，使其在臨床治療與化學(xué)預(yù)防上的應(yīng)用受到極大的限制[35,36]，而O-甲基化能有效提高類黃酮的生物利用度[17]。

O-甲基化類黃酮具有更好的穩(wěn)定性。類黃酮主要以苷類或游離苷元的形式存在于植物中[37]，攝入人體后會進(jìn)行一系列的代謝反應(yīng)。首先，類黃酮苷在小腸中水解成苷元[38,39]，然后在小腸、大腸或結(jié)腸中，與甲基、硫酸鹽基團(tuán)和葡萄糖醛酸發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)[35]，在肝臟完成代謝轉(zhuǎn)化，然后以不同的偶聯(lián)物進(jìn)入血液[38]。由于快速的新陳代謝，攝入富含類黃酮的食物后，血液中類黃酮濃度仍低于10 μM[40]。而O-甲基化修飾可以保護(hù)類黃酮免受肝臟代謝的影響，抑制類黃酮與葡萄糖酸和硫酸鹽結(jié)合，提高其代謝穩(wěn)定性[17]。

在人體內(nèi)，O-甲基化類黃酮具有更好的轉(zhuǎn)運能力[41]，人體內(nèi)外源化合物的運輸主要依賴血清蛋白，O-甲基化提高了類黃酮的蛋白親和力，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)運能力[42]。O-甲基化還降低了類黃酮的水溶性，增強(qiáng)疏水性[43]，這種疏水相互作用在類黃酮與蛋白結(jié)合過程中起到重要作用，從而提高類黃酮的蛋白結(jié)合能力。甲基化通過提高黃酮的穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)運能力，提高其腸道吸收量[17,18]與生物利用度，較其他類黃酮具有更強(qiáng)的藥用活性，更高的生物利用度也進(jìn)一步使得O-甲基化類黃酮能夠穩(wěn)定有效地發(fā)揮藥效。

3 類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶(FOMT)研究進(jìn)展

3.1 FOMT分類

類黃酮的甲基化修飾反應(yīng)，由類黃酮甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成。根據(jù)不同目標(biāo)附著物，甲基轉(zhuǎn)移酶可以簡單地分類為O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)、N-甲基轉(zhuǎn)移酶(NMT)和C-甲基轉(zhuǎn)移酶(CMT)[44,45]。OMT在自然界中廣泛存在，大多數(shù)植物源OMT以二苯乙烯和類黃酮等酚類化合物作為底物[43]。FOMT屬于OMT亞家族，其保守結(jié)構(gòu)域在Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)的索取號為PF01596。

FOMT催化S-腺苷-1-甲硫氨酸(SAM，AdoMet)上的甲基轉(zhuǎn)移到類黃酮上，形成O-甲基衍生物和S-腺苷-1-高半胱氨酸(SAH)[46]?；诎被嵝蛄虚L度可將植物OMT分為兩類[47]，I類OMT的分子量(約23～29 kDa)較低，催化過程需要二價陽離子參與，如：Mg2+、Ca2+；這些二價陽離子起穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，還可直接參與底物與酶的結(jié)合過程[48]。II類OMT的分子量較大(38～43 kDa)，催化過程不需要陽離子參與，這類OMT活性可利用基于組氨酸(His)催化的二元體來增強(qiáng)其酶活性[49]，F(xiàn)OMT大多屬于II類OMT[50]。目前，被報道的部分植物類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶如表3所示。

表3 植物類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶

圖3進(jìn)化樹分析表明，不同物種的FOMT蛋白具有較高同源性。圖中不同顏色代表不同的催化位點，分支1蛋白來自雙子葉植物，分支2蛋白來自單子葉禾本科植物，主要催化3′、4′、5′號位點；分支3蛋白來自雙子葉唇形科植物，主要催化位點為C-7位；除HvF1-OMT外，分支4蛋白均來自雙子葉植物，且大部分屬于豆科，催化C-4′位?？偠灾哂邢嗤呋稽c與相同科屬的FOMT同源性更高。

圖3 不同物種FOMT進(jìn)化樹分析Fig.3 FOMT evolutionary tree analysis of different species

3.2 FOMT功能鑒定

在鑒定FOMT功能時，通常在原核生物大腸桿菌(Escherichiacoli)中過表達(dá)待鑒定基因，純化出該基因編碼的蛋白，再進(jìn)行體外酶活實驗驗證FOMT功能。Itoh等[21]從臺灣香檬(Citrusdepressa)中克隆了5個FOMT基因，其中CdFOMT5在大腸桿菌中成功表達(dá)為可溶性蛋白，體外酶活實驗證實CdFOMT5可對槲皮素，柚皮素，(-)-表兒茶素和雌馬酚的C-3、C-5、C-6和C-7位進(jìn)行甲基化修飾。Liu等[50]從苔蘚類植物Plagiochasmaappendiculatum中克隆了Pa4′OMT基因，在大腸桿菌中成功表達(dá)，并檢測出Pa4′OMT蛋白具有催化芹菜素甲基化的活性。

3.3 FOMT基因的表達(dá)調(diào)控

近期研究表明，植物FOMT的表達(dá)，受環(huán)境與基因的雙重調(diào)控。茉莉酸甲酯(MeJA)的可誘導(dǎo)葛根中PlOMT4基因表達(dá)上調(diào)，3′-O-甲基化異黃酮生物合成量增加[68]。小麥白粉病病原體可誘導(dǎo)大麥F1-OMT基因表達(dá)，促進(jìn)芹菜素7-O-甲基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮作用，生成甲基化抗毒素[54]；而禾谷鐮刀菌侵染大麥后，包括FOMT在內(nèi)的丙烷類生物合成的酶的積累量增加，羥基肉桂酸酰胺和類黃酮含量增加，這使得植物細(xì)胞壁增厚，增強(qiáng)抗病能力[69]。在苜蓿中過表達(dá)IOMT基因，發(fā)現(xiàn)IOMT蛋白可將未受病原菌侵染的苜蓿葉片中的大豆苷元轉(zhuǎn)化為7-O-甲基大豆苷元。此外，使用CuCl2誘導(dǎo)或用莖點霉(Phomamedicaginis)感染的IOMT過表達(dá)植株中，4′-O-甲基異黃酮(芒柄花素)含量升高[70]。

3.4 FOMT的應(yīng)用

作為植物天然產(chǎn)物，許多O-甲基化類黃酮在植物體內(nèi)的含量并不高，而化學(xué)合成步驟繁瑣，操作不便。因此，許多研究者嘗試通過生物合成方法實現(xiàn)O-甲基化類黃酮的大量生產(chǎn)。Lee等[71]構(gòu)建了含3′-OMT(SlOMT3)/7-OMT(OsNOMT)融合蛋白的大腸桿菌，能夠?qū)㈤纹に?、木犀草素、圣草酚、二氫槲皮素，分別轉(zhuǎn)化為甲基鼠李素、氈毛美洲茶素、2-O-甲基圣草酚、2-O-甲基二氫槲皮素。Berim等[72]構(gòu)建了含F(xiàn)OMT的酵母菌株，其能夠催化類黃酮底物產(chǎn)生柚皮素和木犀草素的O-甲基化衍生物。FOMT在O-甲基化類黃酮的生物合成過程中起著重要的調(diào)控作用。

4 前景展望

長期以來，植物類黃酮的藥用價值和生物合成調(diào)控備受關(guān)注，但類黃酮的生物利用度低，使其在藥用開發(fā)上受到限制。甲基化修飾可提高類黃酮的代謝穩(wěn)定性與體內(nèi)轉(zhuǎn)運能力，提高生物利用度，彌補(bǔ)其在臨床應(yīng)用上的短板。近年來，植物O-甲基化類黃酮及FOMT研究成為熱點，隨著植物基因組學(xué)研究的深入，大量植物FOMT基因被發(fā)現(xiàn)，但得到充分功能驗證的FOMT基因還為數(shù)不多。而現(xiàn)階段對于FOMT的研究多采用體外酶催化、生化特征分析等手段，僅有少數(shù)FOMT基因進(jìn)行了體內(nèi)功能驗證，有關(guān)FOMT基因表達(dá)調(diào)控的研究則更為匱乏。隨著O-甲基化類黃酮與FOMT研究的深入，F(xiàn)OMT有望用于O-甲基化類黃酮的工廠化生產(chǎn)，為相關(guān)醫(yī)藥保健品生產(chǎn)提供高性價比原料；此外，O-甲基化類黃酮也是植物體內(nèi)重要的抗逆代謝物，F(xiàn)OMT在綠色農(nóng)藥開發(fā)、作物抗性育種領(lǐng)域也具有較大的應(yīng)用潛力。