郭利平，榮 婧，楊 寧，郭善廣（.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕化工程系，廣東 廣州 5000；.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 5064；.廣東省對(duì)外科技交流中心，廣東 廣州 500）

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羅非魚酶解肽抑制冷藏魚糜中油脂和蛋白質(zhì)氧化能力

郭利平1，榮 婧2，楊 寧3，郭善廣2
（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院輕化工程系，廣東 廣州 510300；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.廣東省對(duì)外科技交流中心，廣東 廣州 510033）

摘 要：將羅非魚的酶解產(chǎn)物及其超濾組分（＜5 kD酶解肽）加入羅非魚魚糜制品中，研究其在冷藏（0～4 ℃）期間對(duì)油脂和蛋白質(zhì)的抗氧化效果。結(jié)果表明：酶解產(chǎn)物及超濾組分均可以改善魚糜的色澤（P＜0.05），尤其是超濾組分的效果接近于一定劑量的VC；酶解產(chǎn)物對(duì)魚糜中的油脂、蛋白質(zhì)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力（P＜0.05），其中超濾組分優(yōu)于酶解液；酶解肽可以有效地保持魚糜在冷藏期間的品質(zhì)，超濾分離富集的＜5 kD的小分子肽顯示出更好的抗氧化效果。

關(guān)鍵詞：魚糜；酶解肽；蛋白質(zhì)氧化；超濾；抗氧化活性

引文格式：

郭利平,榮婧,楊寧,等.羅非魚酶解肽抑制冷藏魚糜中油脂和蛋白質(zhì)氧化能力[J].食品科學(xué),2016,37(5):89-93.

GUO Liping,RONG Jing,YANG Ning,et al.Peptides derived from enzymatic hydrolysis of tilapia viscera inhibit lipid and protein oxidation in refrigerated surimi[J].Food Science,2016,37(5):89-93.(in Chinese with English abstract)

羅非魚（tilapia）肉質(zhì)豐富細(xì)嫩、無小刺、容易分割加工，是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源。有研究表明[1]，羅非魚魚肉蛋白具有較好的凝膠化能力和耐劣化特性，優(yōu)于鰱魚、鳙魚和團(tuán)頭魴魚的凝膠特性，具有良好的魚糜加工特性，是加工魚糜的一種重要的原料。

魚糜制品脂肪及油脂含量較多，且包含較多的不飽和脂肪酸；在加工貯藏過程中，魚糜脂肪和油脂容易氧化變質(zhì)，脂肪氧化會(huì)進(jìn)一步引起蛋白質(zhì)的氧化和損傷，甚至產(chǎn)生一些有毒有害復(fù)合物[2]。為防止脂肪和蛋白質(zhì)氧化，延長保質(zhì)期，一般需要加入適量的抗氧化劑如特丁基對(duì)苯二酚、丁基羥基茴香醚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、沒食子酸丙酯等。隨著消費(fèi)者安全健康飲食意識(shí)的提升，人們對(duì)于食物品質(zhì)的要求有所提高，并開始關(guān)注添加劑的使用。人工合成的抗氧化劑由于其安全性問題使其應(yīng)用受到限制，而一些具有抗氧化性的天然物質(zhì)或其提取物如香辛料[3]、酚類物質(zhì)[4-6]及蛋白水解物[7-8]逐漸引起了人們更多的關(guān)注和研究。

魚類產(chǎn)品作為主要優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源，其酶解產(chǎn)物富含氨基酸、肽與核酸等營養(yǎng)物質(zhì)，而且具有較強(qiáng)的抗氧化活性，近年來成為深度開發(fā)的研究熱點(diǎn)之一[9]。本實(shí)驗(yàn)將羅非魚的酶解產(chǎn)物及其超濾組分加入羅非魚糜中，定期采樣測(cè)定魚糜的色度、pH值、硫代巴比妥酸反應(yīng)（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、羰基價(jià)并通過感官評(píng)定來研究水解肽類對(duì)魚糜油脂和蛋白質(zhì)氧化的抑制效果。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮羅非魚、食用鹽均購自廣州市天河區(qū)長湴農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。羅非魚內(nèi)臟酶解肽制備及超濾分級(jí)分離依照本課題組的前期工作[10]。

二硝基苯肼 天津化學(xué)試劑廠；硫代巴比妥酸天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；鹽酸胍 上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司；抗壞血酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

5804R冷凍高速離心機(jī) 德國艾本德儀器公司；UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；pHS-3C 型精密pH計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司；Labscale小型切向流超濾系統(tǒng) 密理博中國有限公司；SP62色差儀 美國X-rite公司；DS-1電動(dòng)組織搗碎機(jī)上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3方法

1.3.1魚糜的制作及貯藏處理

新鮮羅非魚宰殺后去骨取肉，放入高速組織搗碎機(jī)中搗碎，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的食鹽即為魚糜樣品。取4 組等量的魚糜，第1組加入等體積蒸餾水作為空白對(duì)照組；第2組加羅非魚內(nèi)臟蛋白酶解液，其中肽含量為0.5%（以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)）；第3組加超濾后分子質(zhì)量＜5 kD的羅非魚內(nèi)臟蛋白酶解液，含量為0.5%（以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)）；第4組加入抗壞血酸（VC）溶液，添加量為0.5 mg/g。酶解液與VC的添加量以本課題組前期水解肽的抗氧化能力研究[10]為參考依據(jù)?；旌暇鶆蚝髮⒚拷M分成6 份，塑料袋密封后4 ℃條件下保存，分別在第0、2、4、6、8、10天測(cè)定樣品的色澤、pH值、TBARS值、羰基含量，并進(jìn)行感官評(píng)定。

1.3.2理化指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1色差的測(cè)定

樣品打開包裝30 min后用色差儀測(cè)定肉樣的L*、 a*、b*值。儀器經(jīng)自檢及調(diào)零、黑板、白板校正后，取一定量的肉餡，將其放入比色皿中，并將測(cè)試探頭放在比色皿上進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)試樣隨機(jī)取5 點(diǎn)測(cè)定，取平均值。L*表示明度，a*和b*表示色度，a*正值表示偏紅，負(fù)值表示偏綠；b*正值表示偏黃，負(fù)值表示片藍(lán)。白度（W）值計(jì)算公式如下[11]。

1.3.2.2pH值的測(cè)定

按照GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品 pH測(cè)定》方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.3TBARS值的測(cè)定

參照Sinnhuber等[12]的方法。取0.3 g待測(cè)樣品加入3 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% TBARS溶液，再加入17 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，混勻后，在沸水浴中反應(yīng)30 min，自然冷卻后，取5 mL上述樣品溶液加入等體積的氯仿，3 000×g離心10 min，于532 nm波長處測(cè)定吸光度。TBARS值以每千克脂質(zhì)氧化樣品溶液含有丙二醛的毫克數(shù)表示。計(jì)算公式如下：

式中：A為吸光度；V為樣品體積/mL；M為丙二醛的摩爾質(zhì)量72.063 g/mol；ε為摩爾吸光系數(shù)，此處為156 000 L/（mol·cm）；l為光程/cm；m為肉樣質(zhì)量/g。

1.3.2.4 羰基含量的測(cè)定

參照Fagan[13]和Oliver[14]等的方法。取3.0 g魚糜樣品與15 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）混合后冰浴均質(zhì)，過濾，取0.5 mL樣品溶液，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% TCA在4 ℃、5 000×g離心10 min，沉淀部分即為提取的蛋白質(zhì)。樣品組加入1 mL 10 mmol/L二硝基苯肼（用2 mol/L HCl溶液溶解），室溫下暗處靜止1 h（每15 min渦旋振蕩一次），添加1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% TCA，4 ℃、10 000×g離心5 min，棄上清，用1 mL乙酸乙酯-乙醇（1∶1，V/V，現(xiàn)配現(xiàn)用）洗滌沉淀3 次，再重新溶解沉淀在3 mL的6 mol/L鹽酸胍溶液中（用20 mmol/L磷酸鉀溶解），在37 ℃條件下充分溶解15 min，5 000×g離心3 min，除去不溶解物質(zhì)，清液在370 nm波長處測(cè)定吸光度。空白對(duì)照組用1 mL 2 mol/L HCl代替二硝基苯肼，操作同上。羰基含量計(jì)算公式如下。

式中：As為測(cè)定管吸光度；A0為空白管吸光度；l為比色管光徑/cm；ρ為樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/L）。

1.3.3感官評(píng)定

參照文獻(xiàn)[15]方法，并略微改動(dòng)。選定8 位實(shí)驗(yàn)人員，對(duì)魚糜進(jìn)行色澤、氣味、酸敗味和總體可接受度四方面的感官評(píng)價(jià)，感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1　魚糜感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standards for the sensory evaluation of surimi

2　結(jié)果與分析

2.1酶解產(chǎn)物對(duì)羅非魚魚糜色澤的影響

在鮮肉貯藏期間，表面的肌紅蛋白以3 種形態(tài)存在（肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白、氧化肌紅蛋白）且可以相互轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致肉色的變化[16]。在肉品生產(chǎn)中可以通過添加抗氧化劑、發(fā)色劑和包裝的方法來保持肉品的色澤。這些方法一般都是通過阻止色素氧化或促進(jìn)某一種色素的形成來體現(xiàn)的。也有研究報(bào)道，在牛肉中脂肪氧化和色素氧化是相伴而生的[17]，而且脂肪氧化是色素氧化的促進(jìn)因子。凍藏、蛋白質(zhì)變性則會(huì)影響魚糜凝膠的色澤[18]，魚糜中變性蛋白質(zhì)、氧化油脂和氧化肌紅蛋白的累積導(dǎo)致褐變發(fā)生。由圖1可知，在貯藏期內(nèi)，添加VC和酶解產(chǎn)物樣品的白度值均高于空白對(duì)照組樣品。其中，添加了VC和＜5 kD酶解肽的魚糜樣品白度值無顯著差異（P＞0.05），色澤保持較好，均顯著優(yōu)于添加酶解原液魚糜的色澤（P＜0.05）；酶解液魚糜白度值與空白對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）。這一結(jié)果與骨蛋白[19]、鯉魚蛋白[20]酶解物的相關(guān)研究結(jié)果一致，很可能是因?yàn)槊附怆牡目寡趸芰σ种屏唆~糜色澤的劣變。前期的研究結(jié)果[10]也表明羅非魚內(nèi)臟的酶解液具有較強(qiáng)的抗氧化能力，尤其是超濾后＜5 kD的小分子肽的抗氧化能力更接近VC。

圖1　不同處理組羅非魚魚糜在貯藏期間的白度值變化Fig.1 Whiteness change of tilapia surimi with different treatments during storage

2.2酶解產(chǎn)物對(duì)羅非魚魚糜pH值的影響

活體魚肌肉的pH值一般在6.8～7.2范圍內(nèi)，宰殺后體內(nèi)糖原分解和無氧酵解使乳酸累積導(dǎo)致pH值降低[21]。底棲性白肉魚類（如羅非魚）由于糖原含量較低（0.2%～0.4%），死后魚肉的最低pH值可以達(dá)到6.0～6.4。由圖2可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，不同處理組樣品魚糜的pH值逐漸增大。貯藏過程中，VC和酶解液處理組的pH值接近，空白對(duì)照組的pH值較其他處理組高，但各組魚糜pH值的差異均不顯著（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酶解肽和VC對(duì)魚糜的pH值均無顯著影響（P＞0.05），羅非魚魚糜的pH值相對(duì)比較穩(wěn)定，在冷藏期間基本處于6.5～7.0之間，這是一個(gè)非常適合形成魚糜凝膠的pH值范圍。

圖2　不同處理組羅非魚魚糜在貯藏期間的pH值變化Fig.2 pH Change of tilapia surimi with different treatments during storage

2.3酶解產(chǎn)物對(duì)羅非魚魚糜TBARS值的影響

圖3　不同處理組羅非魚糜在貯藏期間TBARS值的變化Fig.3 TBARS value change of tilapia surimi with different treatments during storage

魚肉脂肪中含有較高比例的不飽和脂肪酸，因此抑制脂肪氧化是魚糜加工和貯藏過程中一個(gè)極為重要的問題。圖3是不同處理魚糜樣品在貯藏過程中TBARS值的變化情況。在貯藏初期，各處理樣品之間差異不大（P＞0.05）；隨著貯藏時(shí)間延長，樣品的TBARS值均呈上升態(tài)勢(shì)，但各處理組魚糜的TBARS值均低于空白對(duì)照組（P＜0.05），且各組之間差異均顯著（P＜0.05）。酶解液和＜5 kD酶解肽處理組的TBARS值的變化趨勢(shì)與VC處理組基本一致，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，但＜5 kD酶解液的抗氧化能力更強(qiáng)，接近于VC的抗氧化效果。說明羅非魚內(nèi)臟酶解產(chǎn)物可以作為自由基清除劑，抑制油脂的鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng)，有效控制油脂的氧化。

魚糜這一復(fù)雜的食品體系中存在的金屬離子可誘導(dǎo)脂蛋白、磷脂和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)氧化反應(yīng)及過氧化反應(yīng)，生成丙二醛。丙二醛會(huì)影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶的活性[22-23]。純丙二醛在中性條件下穩(wěn)定，但在酸性條件下不穩(wěn)定，在食品體系中可以繼續(xù)反應(yīng)生成更為復(fù)雜的終產(chǎn)物；因此圖3中丙二醛含量變化呈起伏波動(dòng)狀態(tài)，說明在一個(gè)階段丙二醛的生成量大于其進(jìn)一步反應(yīng)的消耗量，而在另一個(gè)階段丙二醛的生成量小于其進(jìn)一步反應(yīng)的消耗量。

2.4酶解產(chǎn)物對(duì)羅非魚魚糜羰基含量的影響

蛋白質(zhì)羰基化是指蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基如賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸殘基側(cè)鏈中的氨基和/或亞氨基因受H2O2中氧自由基攻擊在金屬（Fe）離子催化氧化系統(tǒng)中轉(zhuǎn)變?yōu)槿┗⒉⑨尫臢H4＋的反應(yīng)過程。蛋白質(zhì)羰基是一些氨基酸在蛋白質(zhì)氧化過程中的一個(gè)早期標(biāo)志，也是蛋白質(zhì)受到自由基攻擊的標(biāo)志，羰基含量直接反映了蛋白質(zhì)損傷的程度。人類的衰老以及某些疾病如心血管病、糖尿病風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)羰基并在人體內(nèi)相關(guān)組織中蓄積[24-25]。

圖4　不同處理組羅非魚魚糜在貯藏期間的羰基含量的變化Fig.4 Carbonyl value change of tilapia surimi with different treatments during storage

由圖4可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，各處理組樣品的羰基含量明顯升高，其中空白對(duì)照組和酶解液組樣品的羰基含量更高，二者無顯著差異（P＞0.05），說明這兩組的蛋白質(zhì)氧化比較嚴(yán)重；而＜5 kD酶解肽處理組和VC組的羰基含量明顯低于前兩組（P＜0.05），＜5 kD酶解肽處理組的羰基含量變化勢(shì)與VC處理組一致，而VC處理組的羰基含量則明顯低于＜5 kD酶解肽處理組，說明VC抑制蛋白氧化效果最為顯著（P＜0.05）。酶解液在抗蛋白氧化能力上與VC有差距，但＜5 kD的酶解肽抗蛋白質(zhì)氧化效果優(yōu)于酶解液（P＜0.05）。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10]表明，酶解液具有較強(qiáng)的還原力和清除超氧陰離子自由基的能力，這可以在一定程度上抑制羰基化過程中金屬離子和H2O2對(duì)蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的催化、氧化作用，從而降低羰基的形成。此外，酶解液可以有效地清除羥自由基，而羥自由基可直接作用于肽鍵，使其斷裂，在斷裂處即產(chǎn)生羰基。

2.5酶解產(chǎn)物對(duì)羅非魚魚糜感官品質(zhì)的影響

由表2可知，隨著貯藏時(shí)間的增加，各處理組魚糜的各項(xiàng)感官評(píng)分逐漸降低。貯藏初期各處理組樣品的色澤亮白，氣味具有魚糜特有的氣味，沒有脂肪氧化味、異味，總體接受度較高；貯藏后期各組處理樣品的色澤出現(xiàn)變化，出現(xiàn)異味，尤其是空白對(duì)照組樣品在感官上已難以被人接受，但VC和＜5 kD酶解肽處理組在氣味和酸敗味方面極顯著優(yōu)于其他組別（P＜0.01）。在整個(gè)貯藏過程中，各組樣品的總體可接受度均呈下降趨勢(shì)，空白對(duì)照組在貯藏末期與其他處理組之間呈顯極著差異（P＜0.01），無法被消費(fèi)者接受。實(shí)驗(yàn)表明酶解液小分子肽具有抗氧化活性，能較好地控制魚糜品質(zhì)的氧化劣變，其中＜5 kD的蛋白酶解肽液對(duì)于魚糜的品質(zhì)保藏效果更好，與VC接近。

表2　不同處理組羅非魚糜在貯藏期間的感官評(píng)定結(jié)果Table 2 Sensory evaluation scores of tilapia surimi with different treatments during storage

3　結(jié) 論

添加酶解產(chǎn)物的魚糜樣品白度值在貯藏期內(nèi)高于空白對(duì)照組樣品，＜5 kD酶解肽樣品白度值與添加VC的樣品沒有顯著性差異（P＞0.05），色澤保持地較好。酶解肽對(duì)魚糜的pH值無顯著性影響（P＞0.05），冷藏期間羅非魚魚糜的pH值穩(wěn)定在6.5～7.0之間，不會(huì)影響魚糜凝膠的形成。酶解液和＜5 kD酶解肽處理組的TBARS值的變化趨勢(shì)顯示肽具有較強(qiáng)的抗氧化能力，但＜5 kD酶解肽處理組的抗氧化能力更接近于VC的抗氧化效果。酶解液具有抗蛋白氧化能力，尤其是＜5 kD酶解肽抗蛋白質(zhì)氧化效果優(yōu)于酶解液（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)表明，酶解液小分子肽具有抗氧化活性，能較好地控制魚糜蛋白質(zhì)品質(zhì)的氧化劣變，其中＜5 kD的蛋白酶解肽液對(duì)于魚糜的品質(zhì)保藏效果更好，與VC接近。酶解肽作為魚糜中油脂和蛋白質(zhì)抗氧化劑具有令人期待的應(yīng)用前景。

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Peptides Derived from Enzymatic Hydrolysis of Tilapia Viscera Inhibit Lipid and Protein Oxidation in Refrigerated Surimi

GUO Liping1,RONG Jing2,YANG Ning3,GUO Shanguang2
(1.Department of Light Chemical Engineering,Guangdong Industry Polytechnic,Guangzhou 510300,China; 2.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 3.Guangdong Science and Technology Exchange Centre,Guangzhou 510033,China)

Abstract:The enzymatic hydrolysate of tilapia viscera and its ultrafi ltration fraction(peptide < 5 kD)were separately added to tilapia surimi to explore their inhibitory effects on lipid and protein oxidation during refrigeration(0–4 ℃).The results showed that both the hydrolysate and its fraction improved the color of tilapia surimi(P < 0.05),especially the latter,which was nearly as effective as VC at a certain dose.The hydrolysate demonstrated strong antioxidant capacity against both lipid and protein oxidation in surimi during storage(P < 0.05),which,however,was inferior to that of its ultrafi ltration fraction.To sum up,the hydrolysate can effectively maintain the quality of surimi during refrigerated storage,and the peptides < 5 kD separated from it by ultrafi ltration possess better antioxidant activity.

Key words:surimi; peptides derived from enzymatic hydrolysis; protein oxidation; ultrafi ltration; antioxidant activity

中圖分類號(hào)：TS254.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）05-0089-05

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605017 10.7506/spkx1002-6630-201605017.http://www.spkx.net.cn 10.7506/spkx1002-6630-201605017.http://www.spkx.net.cn

作者簡介：郭利平（1963—），女，副教授，碩士，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：glp336@126.com

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009B020313003）

收稿日期：2015-03-25