郭秀瑾,胡 楊,尤 娟,熊善柏,*(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070;2.國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心,湖北 武漢 430070)
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微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)下鰱魚糜凝膠的結(jié)構(gòu)演化規(guī)律
郭秀瑾1,2,胡 楊1,2,尤 娟1,2,熊善柏1,2,*
(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070;2.國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心,湖北 武漢 430070)
摘 要:以鰱魚糜為對(duì)象,通過檢測微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase,MTGase)誘導(dǎo)下不同凝膠化時(shí)間形成的魚糜凝膠的質(zhì)地特性、交聯(lián)程度及網(wǎng)絡(luò)微觀結(jié)構(gòu),探討鰱魚糜凝膠的結(jié)構(gòu)演化規(guī)律。力學(xué)特性結(jié)果表明,未添加MTGase(對(duì)照組)的魚糜凝膠的破斷力、凹陷深度、硬度、咀嚼性等隨凝膠化時(shí)間延長顯著增大(P<0.05),破斷力在3~6 h達(dá)到平衡(約1 100 g),凹陷深度在1~2 h達(dá)到最大值(約17 mm),隨著凝膠時(shí)間延長呈下降趨勢;添加MTGase的魚糜凝膠破斷力在3 h時(shí)就達(dá)到最大值(P<0.05),硬度和咀嚼性隨時(shí)間增加到3 h后趨于平衡,凹陷深度隨時(shí)間延長逐漸降低(P<0.05)。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)結(jié)果顯示,鰱魚糜凝膠中肌球蛋白重鏈含量隨凝膠化時(shí)間延長顯著下降,添加MTGase組肌球蛋白重鏈含量明顯低于對(duì)照組。兩組魚糜凝膠的網(wǎng)絡(luò)孔隙當(dāng)量直徑均隨凝膠化時(shí)間延長先減小后增大,在3 h時(shí)分別達(dá)到最致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(P<0.05)。對(duì)照組和添加MTGase的鰱魚糜凝膠分別在40 ℃凝膠化3~6 h或2~4 h時(shí)凝膠特性較好,通過凝膠化時(shí)間的調(diào)節(jié)可控制魚糜凝膠的結(jié)構(gòu)演化方向,獲得高品質(zhì)魚糜制品。
關(guān)鍵詞:魚糜凝膠;微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶;結(jié)構(gòu)演化;微觀結(jié)構(gòu);交聯(lián)程度
引文格式:
郭秀瑾,胡楊,尤娟,等.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)下鰱魚糜凝膠的結(jié)構(gòu)演化規(guī)律[J].食品科學(xué),2016,37(5):6-11.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605002.http://www.spkx.net.cn
GUO Xiujin,HU Yang,YOU Juan,et al.Structural evolution of MTGase-induced silver carp surimi gels[J].Food Science,2016,37(5):6-11.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605002.http://www.spkx.net.cn
近年來,全球海洋漁業(yè)資源由于過度捕撈和環(huán)境污染等原因日益匱乏,淡水魚作為原料生產(chǎn)魚糜及其制品已成為主要發(fā)展趨勢。我國是淡水魚養(yǎng)殖大國,白鰱魚是我國大宗低值淡水魚之一,2012年產(chǎn)量達(dá)368.78 萬t[1],因其具有產(chǎn)量大、價(jià)格便宜等特點(diǎn),可作為魚糜及其制品生產(chǎn)的優(yōu)良原料。但鰱魚屬于難凝膠化、易凝膠劣化魚種[2],單純以鰱魚糜為原料形成的魚糜凝膠強(qiáng)度較低,添加微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase,MTGase)后因其能夠催化魚蛋白中的谷氨酸(Glu)γ-羧基酰胺基與賴氨酸(Lys)的ε-氨基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)作用而顯著增強(qiáng)魚糜凝膠特性[3-5]。國內(nèi)外的研究多集中在單獨(dú)的內(nèi)源TGase或外源MTGase添加量對(duì)魚糜凝膠化過程的影響,如Yongsawatdigul等[6]研究發(fā)現(xiàn)金線魚魚糜在自身存在的內(nèi)源TGase作用下適當(dāng)延長凝膠化時(shí)間,其魚糜凝膠強(qiáng)度和肌球蛋白重鏈交聯(lián)程度顯著增加。Benjakul等[7]研究了內(nèi)源TGase對(duì)大眼鯛魚魚糜凝膠化過程的影響。還有學(xué)者研究了高壓處理對(duì)TGase誘導(dǎo)阿拉斯加鱈魚魚糜及魚明膠和MTGase聯(lián)合作用對(duì)金線魚魚糜凝膠特性的影響[5,8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在魚糜自然pH值(接近中性)下,6~10 U/g pro是鰱魚糜中MTGase的最適宜添加量,能顯著提高其凝膠特性[9-10]。然而,對(duì)內(nèi)源轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(endogenous transglutaminase,ETGase)或外源添加的MTGase誘導(dǎo)鰱魚糜凝膠的對(duì)比及隨凝膠化時(shí)間延長過程中其凝膠結(jié)構(gòu)的演化規(guī)律卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以鰱魚冷凍魚糜為原料,根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果固定MTGase添加量為10 U/g pro,以未添加MTGase為對(duì)照組,研究40 ℃條件下凝膠化時(shí)間對(duì)該酶誘導(dǎo)的鰱魚糜凝膠的質(zhì)地特性、交聯(lián)程度、微觀結(jié)構(gòu)的影響,探討其結(jié)構(gòu)演化規(guī)律,以期為開發(fā)高品質(zhì)魚糜制品奠定基礎(chǔ)。
1.1材料與試劑
冷凍白鰱魚糜(AAA級(jí)),購于洪湖井力水產(chǎn)食品有限 公司。
MTGase(酶活力3 000 U/g,生化級(jí)) 瑞士科納提克公司;氯化鈉、無水乙醇等(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
CA-1擂潰機(jī) 金盛號(hào)鐵工廠;TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀美國Stable Micro Surrey公司;JSM-6390 PLV型掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司;TDL-5A臺(tái)式離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司;Bio-Rad電泳儀 美國Bio-Rad公司;UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司。
1.3方法
1.3.1魚糜凝膠的制備
以白鰱冷凍魚糜為材料,經(jīng)刨冰、空擂5 min,添加MTGase(10 U/g,以魚糜總蛋白含量計(jì))和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%食鹽等,再經(jīng)擂潰25 min、灌入腸衣、封口,置于40 ℃條件下凝膠化不同時(shí)間(0、1、2、3、4、6、10 h)、再于90 ℃條件下加熱30 min制成魚糜凝膠(TG組),以不添加MTGase的魚糜凝膠作對(duì)照(CK組)。制得的魚腸迅速用流水冷卻后置于4 ℃冷藏過夜,檢測。
1.3.2魚糜凝膠穿刺性能的測定
將魚糜凝膠切成2 5 m m長的圓柱體,參考Tadpitchayangkoon等[11]的方法,在室溫下用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行穿刺實(shí)驗(yàn),測定破斷強(qiáng)度、凹陷深度。測試參數(shù)如下:P/0.25S探頭,觸發(fā)力5 g,測試前速率5.0 mm/s,測試中速率1.0 mm/s,測試后速率5.0 mm/s,穿刺距離20 mm。
1.3.3魚糜凝膠質(zhì)地剖面分析(texture profile analysis,TPA)質(zhì)構(gòu)性能的測定
將魚糜凝膠切成25 mm長的圓柱體,參考Pons等[12]的方法,將斷面的中心置于TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀探頭的正下方的樣品臺(tái)上,每個(gè)樣品進(jìn)行兩次軸向壓縮測定,測定指標(biāo)為硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性。測試條件如下:P/36R探頭;觸發(fā)力5 g;測試前速率2.0 mm/s;測試中速率1.0 mm/s;測試后速率1.0 mm/s;壓縮比50%;停留時(shí)間:5 s。
1.3.4十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)分析
SDA-PAGE參照Yin等[13]方法略做改進(jìn)后進(jìn)行。取2 g魚糜凝膠加入18 mL 50 g/L SDS后采用高速分散均質(zhì)機(jī)均質(zhì),再于85 ℃的水浴中保溫1 h來溶解樣品中的蛋白質(zhì),隨后11 000 r/min離心30 min取上清液,用Lowry法測上清液中蛋白質(zhì)含量,并調(diào)整到蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL,進(jìn)樣體積為5 μL。用質(zhì)量濃度1.25 g/L的考馬斯亮藍(lán)R-250染色,脫色液(體積分?jǐn)?shù)50%甲醇、體積分?jǐn)?shù)10%醋酸)脫色后進(jìn)行掃描成像。
1.3.5 魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察
將魚糜凝膠切成小塊,用0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液配制的2.5%戊二醛固定2 h。上述樣品分別經(jīng)體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、80%、95%和100%的乙醇梯度脫水各20 min,用醋酸異戊酯和100%乙醇等體積混合液脫乙醇20 min,最后用醋酸異戊酯脫乙醇,在HCP-2臨界點(diǎn)干燥儀上采用臨界點(diǎn)干燥法進(jìn)行干燥,離子濺射儀噴金后,采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察[14]。
1.3.6掃描電鏡圖片處理
本實(shí)驗(yàn)采用公共軟件ImageJ 1.42q及其插件FracLac-2.5 Release 1 d對(duì)掃描電鏡圖片進(jìn)行二值化處理[15-16]。
1.4數(shù)據(jù)處理
所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。采用SAS 8.1軟件和Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析[17]。
2.1凝膠化時(shí)間對(duì)魚糜凝膠力學(xué)特性的影響
圖1 凝膠化時(shí)間對(duì)魚糜凝膠破斷力和凹陷深度的影響Fig.1 Effect of setting time on breaking force and deformation of surimi gels
由圖1a可知,TG組和CK組魚糜凝膠的破斷力都在保溫0~3 h內(nèi)顯著增加(P<0.05),但對(duì)照組在3~6 h時(shí)達(dá)到平衡,添加MTGase的魚糜凝膠在保溫3 h后破斷力迅速下降(P<0.05)。凝膠質(zhì)地的增加主要是由于凝膠化過程中魚糜中內(nèi)源性ETGase和外源添加的MTGase催化更多的肌球蛋白交聯(lián)形成ε-(γ-Glu)-Lys非二硫共價(jià)鍵,相對(duì)于直接90 ℃加熱,低溫凝膠化時(shí)間的適當(dāng)延長有助于蛋白逐漸緩慢伸展從而增強(qiáng)疏水相互作用和二硫鍵,當(dāng)熱變性蛋白緩慢變性時(shí),蛋白聚集將以一種有序的形式形成更規(guī)則的凝膠網(wǎng)絡(luò)[18-19]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)添加TGase的魚糜凝膠的破斷力,在凝膠化時(shí)間為0~4 h時(shí)均高于對(duì)照組,即向魚糜中添加外源MTGase在一定的凝膠化時(shí)間內(nèi)可以誘導(dǎo)形成更堅(jiān)固的凝膠[20]。進(jìn)一步延長保溫時(shí)間到10 h后,兩組破斷力都明顯下降,主要是由于魚糜凝膠中內(nèi)源酶的作用使魚糜凝膠劣化導(dǎo)致[6]。由圖1b可知,對(duì)照組魚糜凝膠的凹陷深度隨保溫時(shí)間延長呈先顯著升高后下降的趨勢,添加MTGase的魚糜凝膠凹陷深度則隨凝膠化時(shí)間的延長而明顯下降,且添加MTGase的魚糜凝膠的凹陷深度基本都明顯低于對(duì)照組的,可能是由于過度凝膠化將導(dǎo)致魚糜凝膠質(zhì)地變硬且可壓縮性變?nèi)鮗21]。
圖2 凝膠化時(shí)間對(duì)魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of setting time on texture properties of surimi gels
TPA廣泛應(yīng)用于分析測定魚糜凝膠的多種質(zhì)地特性[22]。由圖2可知,添加MTGase的魚糜凝膠的TPA參數(shù)均大于CK組,因?yàn)檫m量外源MTGase將明顯增加魚糜凝膠的強(qiáng)度(主要包括硬度和內(nèi)聚性)[23]。對(duì)照組魚糜凝膠的硬度隨凝膠化時(shí)間的延長呈顯著增大趨勢(P<0.05),添加MTGase的魚糜凝膠硬度隨時(shí)間延長先迅速上升(P<0.05),3 h后趨于平衡,10 h出現(xiàn)下降。咀嚼性的變化規(guī)律與硬度類似,說明硬度與咀嚼性之間具有良好的正相關(guān)性。兩組魚糜凝膠的內(nèi)聚性和彈性都隨著保溫時(shí)間延長先迅速增大后趨于平衡。凝膠化時(shí)間對(duì)魚糜凝膠的TPA參數(shù)有顯著影響(P<0.05),適當(dāng)?shù)哪z化時(shí)間有助于促進(jìn)內(nèi)、外源TGase的催化作用及魚肉蛋白的舒展,從而提高其質(zhì)地特性,但凝膠化時(shí)間過度延長將使內(nèi)源酶分解作用增加,不利于魚糜凝膠的形成,且添加外源MTGase的魚糜凝膠相對(duì)于對(duì)照組可提前達(dá)到質(zhì)地平衡狀態(tài),縮短凝膠化時(shí)間[18]。
2.2凝膠化時(shí)間對(duì)魚糜凝膠中肌球蛋白交聯(lián)程度的影響
圖3 凝膠化時(shí)間對(duì)魚糜凝膠中肌球蛋白交聯(lián)程度的影響Fig.3 Effect of setting time on MHC cross-linkage of surimi gels
SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示,反映了40 ℃條件下凝膠化不同時(shí)間的肌球蛋白交聯(lián)程度,進(jìn)而了解魚糜在凝膠化過程中蛋白的聚集和降解行為。對(duì)照組魚糜凝膠的肌球蛋白重鏈含量隨凝膠化時(shí)間的延長呈逐漸下降趨勢,但6 h后在100~130、55~70 ku分子質(zhì)量范圍內(nèi)出現(xiàn)新的條帶,說明6 h后內(nèi)源酶催化肌球蛋白重鏈分解形成小分子質(zhì)量鏈段,即發(fā)生凝膠劣化現(xiàn)象[24]。而在前4 h內(nèi)肌球蛋白重鏈的下降則主要是由于凝膠化過程中內(nèi)源TGase催化肌球蛋白重鏈交聯(lián)導(dǎo)致的,這與凝膠質(zhì)地特性的測定結(jié)果基本吻合。在40 ℃條件下可以發(fā)生兩種相矛盾的行為(TGase誘導(dǎo)凝膠增強(qiáng)和內(nèi)源酶作用導(dǎo)致凝膠軟化),最終的凝膠狀態(tài)取決于凝膠化時(shí)間[6]。添加MTGase的魚糜凝膠肌球蛋白重鏈條帶相比于對(duì)照組明顯減少,說明加入外源MTGase后顯著促進(jìn)蛋白交聯(lián)。
2.3凝膠化時(shí)間對(duì)魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響
圖4 凝膠化時(shí)間對(duì)魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of setting time on microstructure of surimi gels
魚糜凝膠的三維結(jié)構(gòu)是影響其質(zhì)地特性的重要因素[25]。圖4顯示了添加MTGase和對(duì)照組白鰱魚糜在40 ℃條件下保溫不同時(shí)間、再于90 ℃加熱0.5 h所制得的魚糜凝膠的掃描電子顯微鏡圖。分形維數(shù)和孔隙當(dāng)量直徑可從不同角度反映魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的致密度及空間復(fù)雜度??紫懂?dāng)量直徑可直觀地反映魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)孔徑的大小,從而表征魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的致密度;分形維數(shù)反映了體系復(fù)雜程度,當(dāng)體系越復(fù)雜時(shí),分形維數(shù)也越大[26]。由圖4可知,隨保溫時(shí)間的延長,魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)越來越規(guī)則和致密,主要是由于適當(dāng)延長凝膠化時(shí)間促進(jìn)蛋白緩慢舒展并在TGase的催化作用下交聯(lián)形成大量多聚體,從而形成更加穩(wěn)定的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[27],但6 h后變得粗糙、不均勻,甚至出現(xiàn)片狀結(jié)構(gòu),凝膠網(wǎng)絡(luò)的破壞與肌球蛋白重鏈被蛋白酶水解有關(guān)[28]。對(duì)圖片中網(wǎng)絡(luò)孔隙進(jìn)行分析所得魚糜凝膠的孔隙當(dāng)量直徑和分形維數(shù)見表1。
表1 凝膠化時(shí)間對(duì)魚糜凝膠孔隙當(dāng)量直徑和分形維數(shù)的影響Table 1 Effect of setting time on pore size and fractal dimension of surimi gels
由圖4和表1可知,凝膠化時(shí)間對(duì)魚糜凝膠的孔隙當(dāng)量直徑有顯著影響(P<0.05),對(duì)照組和添加MTGase的魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)的孔隙當(dāng)量直徑均隨時(shí)間延長呈先下降后升高的趨勢,在保溫3 h時(shí)孔隙當(dāng)量直徑最小,說明此時(shí)凝膠網(wǎng)絡(luò)最為致密,繼續(xù)延長保溫時(shí)間,凝膠孔徑變大,網(wǎng)絡(luò)變得疏松粗糙,與之前的凝膠質(zhì)地特性和交聯(lián)程度的測定結(jié)果相對(duì)應(yīng);魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)的分形維數(shù)隨保溫時(shí)間延長變化差異不是很顯著。1~3 h范圍內(nèi)添加MTGase組的魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)的孔隙當(dāng)量直徑顯著小于對(duì)照組,說明添加MTGase可提高魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)的致密度,改善魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)的彈性、提高魚糜凝膠的脆度。
未添加MTGase(CK組)和添加MTGase(TG組)制備的魚糜凝膠的質(zhì)地特性、交聯(lián)程度及微觀網(wǎng)絡(luò)致密度都隨著凝膠化時(shí)間的延長顯著提高。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組能夠在更短的凝膠化時(shí)間內(nèi)獲得更好的力學(xué)性能(破斷力在3 h時(shí)達(dá)到1 268 g),且表現(xiàn)出顯著性差異;在一定的凝膠化時(shí)間范圍內(nèi)(0~4 h),實(shí)驗(yàn)組肌球蛋白交聯(lián)程度高于對(duì)照組,MTGase的引入能夠相對(duì)延緩凝膠劣化現(xiàn)象的發(fā)生;魚糜凝膠的微觀網(wǎng)絡(luò)孔隙度隨時(shí)間延長先減小后增大,與力學(xué)特性(破斷力)的變化規(guī)律相對(duì)應(yīng),且實(shí)驗(yàn)組魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為致密、脆性更好。因此,通過MTGase添加和凝膠化時(shí)間的調(diào)節(jié)可控制魚糜凝膠的結(jié)構(gòu)演化方向、獲得不同質(zhì)構(gòu)特性和脆性的魚糜制品,結(jié)果可用于指導(dǎo)不同口感的魚糜制品的生產(chǎn)。
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Structural Evolution of MTGase-Induced Silver Carp Surimi Gels
GUO Xiujin1,2,HU Yang1,2,YOU Juan1,2,XIONG Shanbai1,2,*
(1.College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China; 2.National R&D Branch Center for Conventional Freshwater Fish Processing(Wuhan),Wuhan 430070,China)
Abstract:The texture,cross-linkage and microstructure of MTGase-induced silver carp surimi gels at various setting times were measured to explore the pattern of structural evolution.The mechanical testing results showed that the breaking force,deformation,hardness and chewiness of surimi gels without MTGase addition(control group)increased significantly(P < 0.05)with extended setting time.The equilibrium breaking force(1 100 g)was achieved when the setting time was 3–6 h and the highest deformation(17 mm)was obtained in non-MTGase group when the setting time was 1–2 h,followed by a decrease with extended setting time.The highest breaking force,hardness and chewiness were obtained when the setting time was extended up to 3 h in MTGase group,while the deformation decreased significantly(P < 0.05)with the extension of setting time.SDS-PAGE results showed that myosin heavy chain(MHC)content decreased with the extension of setting time and the MHC content of the MTGase group was lower than that of the control group.The pore size of surimi gels decreased first and then increased significantly(P < 0.05),achieving the most compact network structure when the setting time was 3 h.Better properties of surimi gels were obtained when the setting time was 3–6 h in the absence of MTGase or 2–4 h in the presence of MTGase at 40 ℃.To conclude,structural evolution of surimi gels can be controlled by adjusting the setting time to obtain high-quality surimi gel products.
Key words:surimi gel; microbial transglutaminase(MTGase); structure evolution; microstructure; cross-linkage
中圖分類號(hào):TS254.4
文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
文章編號(hào):1002-6630(2016)05-0006-06
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605002
*通信作者:熊善柏(1963—),男,教授,碩士,研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail:xiongsb@mail.hzau.edu.cn
作者簡介:郭秀瑾(1989—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail:xiujin.hi@163.com
基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31371796);國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(大宗淡水魚)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-46-23);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2662015QC014;2662014BQ053)
收稿日期:2015-04-06