彭忠興，李翔，刁勝朋，黃葉青，程靜，劉愛(ài)群，危智盛，余青云，洪銘范

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

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ATRA對(duì)兔頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和炎癥反應(yīng)的影響

彭忠興，李翔，刁勝朋，黃葉青，程靜，劉愛(ài)群，危智盛，余青云，洪銘范

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

目的 通過(guò)構(gòu)建兔頸動(dòng)脈粥樣硬化(AS)模型，觀察全反式維甲酸(ATRA)對(duì)AS斑塊中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、兔白介素-6(IL-6)、兔白介素-10(IL-10)和兔白介素-17(IL-17)的表達(dá)水平，探討ATRA的抗AS作用及其機(jī)制。方法 選取34只純種雄性新西蘭白兔隨機(jī)分為正常組、模型組、他汀組、ATRA組。正常組給予基礎(chǔ)飼料，其余各組給予高脂飼料。實(shí)驗(yàn)4周后他汀組予辛伐他汀2 mg/(kg·d)灌胃給藥，ATRA組予ATRA 20 mg/d灌胃給藥。12周末處死動(dòng)物，取頸動(dòng)脈組織觀察AS斑塊形態(tài)及炎癥反應(yīng)情況，并測(cè)定血清中血脂、TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17的水平。結(jié)果 模型組頸動(dòng)脈可見(jiàn)AS斑塊形成，內(nèi)膜斷裂。他汀組及ATRA組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)膜尚完整。血清中TGF-β1和IL-10水平結(jié)果，ATRA組分別為(3 059.49±599.75)ng/L和(46.83±4.56)ng/L，他汀組分別為(2 709.48±601.44)ng/L和(43.13±4.07)ng/L，均比模型組的(2 039.16±638.07)ng/L和(36.39±7.34)ng/L顯著增高(P<0.05)。血清中IL-6和IL-17水平結(jié)果，ATRA組分別為(64.92±6.64)ng/L和(1 474.88±140.55)ng/L，他汀組分別為(69.54±8.84)ng/L和(1 518.58±136.69)ng/L，均比模型組的(110.00±7.26)ng/L和(2 002.66±195.57)ng/L顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 ATRA具有抗AS的作用，其機(jī)制可能與ATRA的炎癥免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

頸動(dòng)脈粥樣硬化； 全反式維甲酸； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1； 炎癥

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死(atherosclerotic cerebral infarction,ACI)的主要病理基礎(chǔ)，頸AS的進(jìn)展、斑塊的形成與破裂和繼發(fā)的血栓形成(即易損斑塊)是導(dǎo)致ACI的主要原因[1]。因此，抗AS治療是預(yù)防和治療ACI的主要措施之一，雖然臨床上針對(duì)AS的治療方法很多，但結(jié)果仍不夠理想，尋求新的治療靶點(diǎn)和新的藥物迫在眉睫。炎癥反應(yīng)在AS的形成和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[2]，研究顯示全反式維甲酸(all-trans-ratinoic acid，ATRA)在炎癥及免疫反應(yīng)中有著重要的調(diào)控作用[3]。本文旨在通過(guò)建立兔頸AS模型，觀察ATRA對(duì)AS影響，探討ATRA對(duì)頸AS中炎癥反應(yīng)的機(jī)制，為新藥開(kāi)發(fā)和臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性新西蘭大白兔34只，80 d齡，體質(zhì)量(2.0±0.3)kg，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0085。

1.2 試劑、藥品和主要儀器

基礎(chǔ)飼料(廣州花東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng))；膽固醇(廣州拓科達(dá)生物科技有限公司)；兔轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-17(IL-17)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)；ATRA(山東良福制藥有限公司，批號(hào)2012014)；辛伐他汀(杭州默沙東制藥有限公司20130146)；奧林巴斯BX51生物顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)；HITACHI 7180全自動(dòng)生化分析儀(日本Hitachi公司)。

1.3 動(dòng)物模型制備與分組

將健康純種雄性新西蘭白兔34只隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組(正常組)6只、模型組8只、辛伐他汀治療組(他汀組)10只、ATRA治療組(ATRA組)10只。正常組每日每只給予基礎(chǔ)飼料150 g，其余各組每日每只給予150 g高脂飼料(內(nèi)含2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、15%蛋黃粉、10%豬油、72.5%基礎(chǔ)飼料)，4組均自由飲水，飼養(yǎng)12周。

他汀組和ATRA組高脂飼料飼養(yǎng)4周后開(kāi)始灌胃給藥。他汀組予以辛伐他汀片按2 mg/(kg·d)給藥，稀釋于1.5 mL生理鹽水灌胃8周,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。ATRA組予以ATRA 20 mg/d溶于1.5 mL植物油中灌胃8周,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。模型組不使用任何藥物，但與治療組在相同時(shí)間予以等量生理鹽水灌胃8周,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4 血清血脂和炎癥細(xì)胞因子測(cè)定

各組動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)12周末穿刺心臟采血，常溫靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，測(cè)定血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的濃度。采用ELISA試劑盒測(cè)定血清中TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17的水平，嚴(yán)格按照試劑盒和酶標(biāo)儀說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。

1.5 血管形態(tài)學(xué)觀察及測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束,處死動(dòng)物,取約1.0 cm的頸動(dòng)脈病變血管等距離切為3～4段，10%(φ)甲醛緩沖溶液固定，石蠟包埋。將病變血管橫切面(3～4 μm)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察管壁結(jié)構(gòu)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血脂水平變化情況

表1結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組和ATRA組的TG、TC和LDL-C顯著增高(P<0.05)；他汀組的TC和LDL-C顯著增高(P<0.05)。與模型組比較，ATRA組的TG、TC和LDL-C水平無(wú)明顯下降(P>0.05)；他汀組的TG、TC和LDL-C水平則明顯下降(P<0.05)。

表1 各組兔血清血脂水平比較

與正常組比較，#P<0.05； 與模型組比較：*P<0.05。

2.2 血管組織形態(tài)情況2.2.1 肉眼大體觀察 肉眼可見(jiàn)正常組兔頸動(dòng)脈血管管壁光滑，柔軟有彈性；模型組兔頸動(dòng)脈血管管壁增厚、僵硬，可見(jiàn)脂質(zhì)點(diǎn)及脂質(zhì)條紋，可見(jiàn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。他汀組、ATRA組兔頸動(dòng)脈血管管壁增厚，略僵硬，偶可見(jiàn)脂質(zhì)點(diǎn)，與正常組比較病變較輕。2.2.2 顯微鏡下觀察 經(jīng)HE染色后顯示，正常組頸動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)完整，排列整齊，內(nèi)彈力纖維膜清晰完好，動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則，未見(jiàn)明顯斑塊形成；模型組頸動(dòng)脈可見(jiàn)典型的AS斑塊，內(nèi)有纖維帽及脂質(zhì)核心，以及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)彈力纖維膜斷裂，平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜下，動(dòng)脈中膜可見(jiàn)泡沫細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶。他汀組及ATRA組可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)尚完整，部分中斷，內(nèi)彈力纖維膜清晰完好，可見(jiàn)部分平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜下，動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞排列尚整齊，可見(jiàn)部分泡沫細(xì)胞形成及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

A.正常組； B.模型組； C.他汀組； D. ATRA組。

圖1 實(shí)驗(yàn)12周各組兔頸動(dòng)脈血管HE染色(100×)

Figure 1 Morphology of rabbit carotid artery in different groups at 12 weeks (100×)

2.3 血清TGF-β1和IL-10水平檢測(cè)結(jié)果

如表2結(jié)果所示，與正常組比較，模型組血清TGF-β1和IL-10水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，他汀組及ATRA組血清TGF-β1和IL-10水平顯著增高(P<0.05)；ATRA組與他汀組比較，血清TGF-β1和IL-10水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 血清IL-6和IL-17水平檢測(cè)結(jié)果

表2結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組血清IL-6和IL-17水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，他汀組和ATRA組血清IL-6和IL-17水平顯著降低(P<0.05)。

表2 各組兔血清TGF-β1 ELISA檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較：#P<0.05； 與模型組比較:*P<0.05。

3 討論

AS是以血管壁內(nèi)脂質(zhì)蓄積、纖維成分增加和血管壁慢性炎癥為主要特征[4]，炎癥反應(yīng)是AS發(fā)病的決定因素，貫穿了AS的形成和發(fā)展過(guò)程，因此抑制炎癥反應(yīng)是抗AS的重要環(huán)節(jié)。

ATRA是一種天然維生素A的主要衍生物，ATRA通過(guò)與胞核上的受體結(jié)合，發(fā)揮對(duì)組織及細(xì)胞的抑制增生、誘導(dǎo)分化和調(diào)節(jié)凋亡的作用，且對(duì)于多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激酶等都具有很強(qiáng)的調(diào)控增生、誘導(dǎo)分化的作用，是一種較強(qiáng)的分化誘導(dǎo)劑，在炎癥及免疫反應(yīng)中有著重要的調(diào)控作用[3]。近年來(lái)，有ATRA類(lèi)藥物應(yīng)用于預(yù)防和治療AS和動(dòng)脈管腔狹窄的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道，但對(duì)AS的形成與發(fā)展中炎癥反應(yīng)的抑制作用鮮有報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，兔經(jīng)過(guò)高脂飼料飼養(yǎng)12周后其頸動(dòng)脈肉眼及鏡下所見(jiàn)典型的AS斑塊形成，內(nèi)彈力纖維膜斷裂，平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜下，動(dòng)脈中膜可見(jiàn)泡沫細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶，管腔狹窄，證明造模成功。模型組及治療組鏡下均可觀察到炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，證實(shí)了炎癥介質(zhì)參與了血管炎癥反應(yīng)，參與了AS斑塊的形成。ATRA組及他汀組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)完整，內(nèi)彈力纖維膜清晰完好，部分平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜下，動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊，部分泡沫細(xì)胞形成及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)斑塊形成，提示ATRA及辛伐他汀均可以抑制內(nèi)膜增生及平滑肌細(xì)胞的遷移，具有抗AS的作用，但ATRA抗AS作用的具體機(jī)制尚未清楚。

TGF-β1是多功能細(xì)胞因子，對(duì)炎癥因子具有調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1作用于血管平滑肌細(xì)胞從而影響血管的生成及維持血管壁的正常結(jié)構(gòu)，可逆轉(zhuǎn)及改善AS[5]。另外，在內(nèi)皮細(xì)胞中，TGF-β1通過(guò)抑制黏附因子E-選擇素的表達(dá)，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化，使淋巴細(xì)胞募集減少；抑制巨噬細(xì)胞攝取脂肪顆粒，減少泡沫細(xì)胞的形成[6]。TGF-β1促使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化成熟，降低細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞和組織的殺傷，從而減輕炎癥反應(yīng)[7]。內(nèi)皮細(xì)胞活化和泡沫細(xì)胞的形成是AS早期的表現(xiàn)，可見(jiàn)TGF-β1在AS早期就具有抗AS的作用。

IL-10作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生的主要抗炎因子之一，可抑制效應(yīng)性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的激活，在AS進(jìn)程中同樣發(fā)揮了重要作用[8]。

TGF-β1及IL-10的水平上升可抑制致病性的免疫反應(yīng)激活，抑制AS的發(fā)生發(fā)展，反之，TGF-β1及IL-10的水平下降可加重AS斑塊內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，促炎因子合成增多，增加膠原的降解，加速易損斑塊的形成[9]。前期臨床研究也證實(shí)TGF-β1水平降低可加劇AS的進(jìn)展、頸動(dòng)脈斑塊的易損性增加，導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生[10]。

本研究結(jié)果表明兔經(jīng)過(guò)高脂飼料飼養(yǎng)12周后，隨著AS的不斷發(fā)生發(fā)展，AS斑塊形成，模型組血清抗炎因子TGF-β1和IL-10水平明顯下降，Th17細(xì)胞分泌的促炎因子IL-6、IL-17水平明顯上升，經(jīng)過(guò)他汀及ATRA的干預(yù)治療，血清抗炎因子TGF-β1和IL-10水平明顯升高，Th17細(xì)胞分泌的促炎因子IL-6、IL-17水平明顯下降。提示ATRA具有促進(jìn)AS斑塊內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的聚集，并抑制T細(xì)胞向Th17表型的轉(zhuǎn)化，從而降低效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞及組織的殺傷，減輕局部的炎癥反應(yīng)。

本研究還顯示，與他汀類(lèi)藥物主要通過(guò)有效降低LDL-C的水平從而發(fā)揮抗AS作用不同，ATRA并未降低血清LDL-C的水平，提示ATRA的抗AS作用不依賴于血脂的改變，主要通過(guò)抑制動(dòng)脈局部的炎癥反應(yīng)，在AS的不同階段均具有抗AS作用。

綜上所述，ATRA具有抗AS的作用，其機(jī)制可能與ATRA提升血清抗炎因子、降低促炎因子水平的炎癥免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。但炎性因子眾多，炎癥反應(yīng)復(fù)雜，其抗AS作用的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Effect of all-trans retinoic acid on the atherosclerotic plaque and inflammatory response in carotid artery of rabbits

PENG Zhongxing,LI Xiang,DIAO Shengpeng,HUANG Yeqing,CHENG Jing,LIU Aiqun,WEI Zhisheng,YU Qingyun,HONG Mingfan

(DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510080,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of all-trans retinoic acid (ATRA) on the development of atherosclerotic plaque and the expression of TGF-β1,IL-6,IL-10 and IL-17 on the rabbit carotid atherosclerosis model. Method 34 male New Zealand rabbits were randomly divided into four groups,including the normal group,the model group,statin group and ATRA group. The normal group was given basic feed,and other groups were fed with high fat diet. After 4 weeks,rabbits were treated intragastrically with simvastatin D at 2 mg/kg per day or ATRA at 20 g/day. The atherosclerotic plaque and inflammatory response in carotid artery were examined at the end of 12 weeks. Meanwhile,the serum levels of lipids,TGF-β1,IL-6,IL-10 and IL-17 were measured. Result The AS plaque and broken intima were observed in the model groups. The endothelial cell morphology and endometrium were intact in statin- and ATRA-treated groups. Compared with the model group,the levels of TGF-β1 and IL-10 were significantly increased in ATRA group (3 059.49±599.75) and (46.83±4.56)ng/L and statin group (2 709.48±601.44) and(43.13±4.07)ng/L. By contrast,the levels of IL-6 and IL-17 were significantly lowered in ATRA group (64.92±6.64) and (1 474.88±140.55)ng/L and statin group (69.54±8.84) and (1 518.58±136.69)ng/L. Conclusion ATRA ameliorates the development of atherosclerosis in rabbit model,which may be related to reduction of the inflammatory response.

carotid atherosclerosis; all-trans retinoic acid; TGF-β1; inflammation

2016-06-19

廣東藥學(xué)院科技處-附屬第一醫(yī)院聯(lián)合自然科學(xué)培育基金項(xiàng)目(GYFYLH201322)

彭忠興，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事腦血管病的基礎(chǔ)和臨床研究，Email:pzx802@163.com。

時(shí)間：2016-10-21 11:10:58

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161021.1110.001.html

R965

A

1006-8783(2016)05-0639-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016061902