陳艷琳,王穎芳

(廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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microRNA定量檢測方法研究現(xiàn)狀

陳艷琳,王穎芳

(廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

MicroRNA(miRNA)是一類由18～24 nt核酸構(gòu)成的非編碼內(nèi)源性小分子RNA，主要參與真核生物的細(xì)胞分化、增殖與凋亡等轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與腫瘤、代謝調(diào)控、疾病發(fā)生及診斷等方面有密切的聯(lián)系，因此準(zhǔn)確且靈敏地進(jìn)行miRNA的定量檢測是深入研究miRNA功能的前提。目前，miRNA定量檢測原理主要基于核酸雜交或擴(kuò)增，包括Northern印跡、微陣列芯片、實時定量PCR、滾環(huán)擴(kuò)增等。本文通過對傳統(tǒng)miRNA檢測方法、高靈敏度新型miRNA檢測方法進(jìn)行闡述與分析，為篩選合適的miRNA定量檢測方法提供參考。

microRNA； 實時定量PCR； 滾環(huán)擴(kuò)增； Northern印跡

在現(xiàn)代生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究中，microRNA(miRNA)是真核生物體內(nèi)必不可少的調(diào)節(jié)因子。多數(shù)成熟miRNA具有高保守性，其可通過與靶mRNA 3′末端非翻譯區(qū)( untranslational region,UTR)完全或不完全堿基配對，使靶mRNA降解或抑制翻譯，進(jìn)而參與轉(zhuǎn)錄后水平的靶基因表達(dá)調(diào)控[1-2]。研究表明，在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中，miRNA可作為一種分子標(biāo)志物對靶基因介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)控[3-4]，這為miRNA作為新的生物標(biāo)志因子用于癌癥等重大疾病的早期診斷提供依據(jù)，也揭示了miRNA在評估疾病表達(dá)水平中的重要性。

成熟miRNA的表達(dá)具有時空特異性、組織特異性[5-6]，在生物體內(nèi)能抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯等，所以在多種真核生物過程中發(fā)揮著重要作用，尤其在細(xì)胞發(fā)育、植物生長等調(diào)控表達(dá)尤為突出。隨著對miRNA、siRNA等小分子RNA的大量深入研究，發(fā)現(xiàn)miRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)在治療及診斷疾病中發(fā)揮著重大作用，研究者運用分子生物信息學(xué)分析技術(shù)證實miRNA及其靶mRNA的存在[7]，至今為止，挖掘出人類基因組中的miRNA已超過1 000種[8]。這使得miRNA定量檢測成為研究miRNA結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，但因成熟miRNA序列短小，沒有poly(A)尾巴，在細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)，家族成員間序列特異性差等，使miRNA定量檢測難度很大[9-10]。為解決這一難關(guān)，近年來建立了多種靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡便及高通量的方法，其中基于探針雜交不需要樣本擴(kuò)增和樣本miRNA擴(kuò)增是應(yīng)用最廣泛的兩種方法。在這兩種方法的基礎(chǔ)上，建立多種DNA擴(kuò)增技術(shù)如恒溫滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、微陣列芯片、探針標(biāo)記技術(shù)以及可克服檢測通量極限等新方法[11]。本文主要對應(yīng)用廣泛、新型miRNA檢測方法展開論述及分析，以期為研究者進(jìn)行miRNA研究提供借鑒。

1 microRNA傳統(tǒng)檢測方法

1.1 Northern blotting印跡分析

印跡雜交技術(shù)(Northern blotting)是最早應(yīng)用在miRNA定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法運用標(biāo)記的DNA探針與硝酸纖維素膜上的miRNA進(jìn)行互補(bǔ)雜交，通過顯影檢測目標(biāo)條帶[12-13]。Northern blotting印記分析常采用同位素、熒光或納米金標(biāo)記DNA,此過程操作嫻熟，可探知被檢測miRNA的分子大小、凸顯其豐度，且對儀器要求簡單，因此一直被用于miRNA檢測。但該存在法操作費時費力、耗樣量大、高通量檢測準(zhǔn)確度低等缺點。

鎖核酸( locked nucleic acid，LNA)探針檢測方法顯著彌補(bǔ)了Northern blotting印跡法的缺陷。LNA是一種新的雙環(huán)寡聚核苷酸類似物，通過呋喃環(huán)的2′-O和4′-C不同程度縮水形成亞甲基橋并連接成環(huán)狀的N-構(gòu)象結(jié)構(gòu)，可任意摻入到DNA中，使磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性增加，進(jìn)而提高miRNA檢測的敏感度和特異性。運用LNA對Northern 印跡雜交技術(shù)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，已廣泛應(yīng)用在普通miRNA檢測過程中[14]。

1.2 微陣列芯片

微陣列芯片(microarray)是miRNA高通量分析方法的一種，能實現(xiàn)定時定量檢測多個miRNA樣品，在miRNA表達(dá)差異譜分析中應(yīng)用較廣[15]。該方法將多個已知序列的探針與miRNA雜交的芯片固定在固相支持物上，根據(jù)雜交后檢測到的信號強(qiáng)度及數(shù)據(jù)分析，從而構(gòu)建特異miRNA的表達(dá)譜。高通量是微陣列芯片檢測miRNA的最大優(yōu)勢，但常伴有假陽性結(jié)果，在基因芯片制作和檢測費用、探針類型及特異性等方面還存在缺點[16]，常用于miRNA的初步篩選[17]，難以在普通實驗室普及。

基于微球雜交的流式細(xì)胞檢測方法(Bead-based hybridization technology)改善了微陣列芯片的不足，將新載入的微球看作傳統(tǒng)微陣列芯片上的一個點，這一特性不僅有助于捕獲待測靶miRNA，且能避免固態(tài)芯片中的交叉反應(yīng)。盡管芯片技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測，但在發(fā)現(xiàn)新miRNA的技術(shù)支持上比較薄弱，還需進(jìn)一步的改進(jìn)。

1.3 實時熒光定量PCR法(qPCR)

實時熒光定量PCR是高靈敏檢測低表達(dá)miRNA最常見的方法之一[10]，尤其針對樣本miRNA表達(dá)量低、樣本間基因差異小等情況。該方法是在PCR反應(yīng)體系中加入特殊的熒光基團(tuán)，經(jīng)由熒光信號來實時定量觀察PCR的全進(jìn)程，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行未知模板的定量分析。實時定量PCR一方面可檢測極微量的miRNA基因表達(dá)及預(yù)測新穎miRNA；另一方面熒光標(biāo)記核酸化學(xué)和寡核苷酸探針雜交技術(shù)的發(fā)展，促使qPCR成為定量檢測miRNA的得力手段。目前，利用qPCR技術(shù)定量檢測miRNA的方法主要包括莖環(huán)RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)和poly(A)加尾RT-PCR方法。

1.3.1 RT-PCR

莖環(huán)RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)可利用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物對miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用3′末端所含的與miRNA反向互補(bǔ)的莖環(huán)引物進(jìn)行miRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄，新合成miRcDNA可用于實時定量PCR擴(kuò)增。此莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)引物對成熟的miRNA 3′端具有特異性，能夠?qū)⒍痰膍iRNA擴(kuò)展，并且具有通用的3′引物位點進(jìn)行實時PCR。該技術(shù)也被認(rèn)為是先形成一種空間阻礙以阻止對前體miRNA進(jìn)行PCR引導(dǎo)，再利用實時PCR進(jìn)行高特異性的定量檢測miRNA的表達(dá)水平。因莖環(huán)法特異性好、不需要標(biāo)記、能夠檢測出低豐度靶mRNA、引物設(shè)計過程簡單及精確性高等優(yōu)點，逐漸成為定性檢測miRNA的優(yōu)勢方法。其缺點是實驗材料及儀器較昂貴。

1.3.2 polyA聚合酶加尾法

成熟miRNA分子剪接修飾后序列短小，常規(guī)的RT-PCR技術(shù)無法實現(xiàn)miRNA的定量或半定量檢測，通常采用poly(A)加尾法進(jìn)行miRNA的檢測。在poly(A)聚合酶的作用下，miRNA的3′端加上一段寡聚腺苷酸的尾巴，形成一個與mRNA相似的結(jié)構(gòu)，再用5′端帶有oligo(dT)的通用引物反轉(zhuǎn)錄生成miRcDNA[18]，用于下一步的實時PCR反應(yīng)。該引物由兩部分組成：一部分為poly(T)12VN(V=A，G，C；N=A，T，G，C)，另一部分為通用引物5′-GCGAGCACAGAATTAATAC GAC-3′。與RT-PCR法對比，polyA聚合酶加尾法能一次性進(jìn)行所有miRNA的加尾反應(yīng)，檢測特異性及靈敏度都較高；但此方法操作繁瑣，檢測費用較高，且無法實現(xiàn)定量檢測。

為了克服以上劣勢，poly(U)加尾miRNA檢測方法應(yīng)運而生[19]。此方法是利用polyU聚合酶在miRNA 3′端添加U的尾巴，逆轉(zhuǎn)錄為miRcDNA，再用通用引物5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′實時定量PCR。與ployA聚合加尾相比，Poly U加尾法是前者方法的擴(kuò)展和補(bǔ)充，具有更廣泛的適用性，具有良好的特異性及靈敏性，此方法為miRNA的檢測分析及分子機(jī)制研究提供了良好的應(yīng)用前景。

2 microRNA檢測新方法

2.1 納米粒子(Nano String)讀數(shù)技術(shù)

納米粒子讀數(shù)技術(shù)是利用等離子體共振成像(SPRI)技術(shù)[20]及表面聚合反應(yīng)進(jìn)行miRNA檢測。首先用一個連接序列與待檢測的miRNA特異性結(jié)合，將此復(fù)合物與單鏈LNA標(biāo)記的捕獲探針和納米金標(biāo)記的核酸信號探針(約30個堿基T組成)雜交，經(jīng)由SPRI技術(shù)檢測分析，獲得讀數(shù)?；诩{米材料良好導(dǎo)電性，能使電子在生物分子和電極表面自由移動的原理，納米材料讀數(shù)技術(shù)的miRNA電檢測研究獲得了理想的結(jié)果。

Yin[21]等將生物素標(biāo)記的單鏈信號DNA與鎖核酸固定在納米金上，形成生物素標(biāo)記探針，將電極上的發(fā)卡探針與miRNA特異性雜交，并把生物素探針和鏈霉親和素標(biāo)記辣根過氧化氫酶加入到體系中，然后進(jìn)行酶學(xué)擴(kuò)增信號的檢測，建立了靈敏度極高的miR-21電化學(xué)檢測miRNA法。Dong等[22]將帶有耦合Hg2+的分子信標(biāo)(MB)與作為熒光基團(tuán)的Ag納米簇(AgNCs)，在核酸內(nèi)切酶的輔助下進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)應(yīng)用到miRNA的檢測，不僅避免復(fù)雜的溫度控制及標(biāo)記，且大大提升miRNA檢測限。隨著對miRNA檢測技術(shù)的深入探索，發(fā)現(xiàn)將光學(xué)檢測與納米粒子檢測聯(lián)用可使生物樣品檢測靈敏度和檢測范圍極大地提高。Alhasan等[23]研發(fā)出一種針對低表達(dá)量miRNA的Scanometric miRNA檢測方法，其檢測靈敏度及檢測范圍都較強(qiáng)。首先，以T4 RNA連接酶2為介導(dǎo)，將miRNA與通用DNA分子連接，與miRNA微陣列雜交后，利用通用球狀核苷酸化的AuNPs捕獲雜交的微陣列miRNA，再利用金沉積擴(kuò)增、成像。

納米粒子讀數(shù)技術(shù)可實現(xiàn)miRNA檢測的高靈敏度、高通量、高特異性等要求，無需序列擴(kuò)增和逆轉(zhuǎn)錄,可實時檢測。但納米粒子易受外界溶液PH或離子強(qiáng)度的影響。此外，探針密度也會影響特異性雜交效率，因此在選擇納米技術(shù)檢測miRNA時要盡量規(guī)避上述問題。

2.2 基于RCA檢測方法

滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification，RCA)是一種恒溫核酸擴(kuò)增方法。設(shè)計的引物與環(huán)狀DNA分子連接后，聚合酶將連續(xù)復(fù)制出無數(shù)個環(huán)的互補(bǔ)序列拷貝，這是與PCR差異之處。該方法可在短時間內(nèi)使目標(biāo)miRNA分子數(shù)量倍增，使檢測信號放大，反應(yīng)過程無需特殊儀器設(shè)備，可廣泛地應(yīng)用在RNA、DNA和蛋白質(zhì)，尤其miRNA的定量檢測分析[24]。

Jonstrup等[25]首次把RCA技術(shù)應(yīng)用到miRNA檢測上，該研究將miRNA做為連接模板與探針連成環(huán)，并作為引物在聚合酶的作用下引發(fā)RCA反應(yīng)。一些研究者在此基礎(chǔ)上，改進(jìn)RCA擴(kuò)增技術(shù)，使miRNA檢測靈敏度及特異性大大提升。Cui等[26]建立滾環(huán)-循環(huán)酶雙擴(kuò)增法(RCA-CEAM)，即將RCA與CEAM(循環(huán)酶擴(kuò)增)聯(lián)用檢測miRNA表達(dá)，使檢測靈敏度大大地提高至12fm。Ge等[27]設(shè)計滾環(huán)擴(kuò)增-熒光原位檢測法(TPRCA-FISH),該方法是基于靶細(xì)胞引發(fā)的滾環(huán)擴(kuò)增，以circular DNA為探針與靶miRNA結(jié)合，然后miRNA游離的3′末端發(fā)生RCA反應(yīng)，進(jìn)而擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光探針原位雜交。該方法產(chǎn)生的雜交信號很強(qiáng)，且易與背景信號區(qū)分，能夠簡便快速地檢測低豐度表達(dá)的miRNA。Wen等[28]將RCA、切口酶信號擴(kuò)增及DNA酶信號擴(kuò)增結(jié)合起來，使miRNA定量檢測水平提升至2 amol/L。Liu等[29]將鎖探針-RCA與切口酶信號擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)用，設(shè)計出P-ERCA法(padlock probe-based exponential RCA)，RCA擴(kuò)增檢測的效率進(jìn)一步提高，使miRNA在高通量分析中更加精確。

盡管滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)特異性強(qiáng)、檢測范圍廣、可區(qū)分miRNA單堿基的差異，在構(gòu)建miRNA高通量檢測的微陣列上也有獨特的優(yōu)勢，但該法擴(kuò)增耗時長、工具酶價格昂貴、RCA模板合成難度大，故在miRNA定量檢測的應(yīng)用中并不常見。

2.3 基于酶信號放大的電化學(xué)檢測

根據(jù)酶具有催化作用，可使單個雜交分子轉(zhuǎn)變成大量的檢測分子的特性，可將酶作為生物分析的標(biāo)簽，這一特性使基于酶的電化學(xué)檢測越來越多的應(yīng)用到miRNA檢測中。Pohlmann等[30]設(shè)計了一種間斷雜交檢測miRNA的電化學(xué)方法，采用DNA/RNA雜交鏈及酯霉素-2-脫氧核苷酸(EST-2-ODN)作為化學(xué)檢測標(biāo)志物，進(jìn)行miRNA的定量檢測。此方法依據(jù)互補(bǔ)原則將miRNA與檢測核苷酸固定在探針上，使用標(biāo)記酶與之雜交。Lin等[31]將第三代E-DNA傳感器應(yīng)用到miRNA檢測，其中具莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA的熱力學(xué)穩(wěn)定性使背景信號降低，增強(qiáng)反應(yīng)特異性，再使用生化酶進(jìn)行電化學(xué)信號擴(kuò)增。此方法在區(qū)分高保守性的miRNA家族成員上有極大優(yōu)勢。Deng等[32]將靶標(biāo)miRNA與綁定在特殊磁珠上的探針(DZ-CPs)雜交，再使用特異性核酸酶切割，通過磁鐵將未反應(yīng)的DZ-CPs及磁珠去掉，以余下溶液中的DNA分子看作催化劑，在過氧化氫的存在下催化3,3′,5,5′-聯(lián)苯胺，再采用比色法進(jìn)行高靈敏度檢測。

酶信號擴(kuò)大檢測miRNA雖滿足了高靈敏度、高特異性等要求，但仍存在擴(kuò)增模板序列設(shè)計不易成功、背景信號高等缺陷，故酶輔助miRNA的電化學(xué)檢測法仍需大力改進(jìn)。

2.4 測序法[33]

以上關(guān)于miRNA的檢測均是用于單個且已知序列miRNA的測定，無法對未知序列的miRNA進(jìn)行檢測。新一代大規(guī)模測序、miRNA芯片、克隆和Nano String讀數(shù)等可用于特定樣品中的miRNA種類及特定miRNA的表達(dá)分析，但樣品必須先進(jìn)行擴(kuò)增才能開展測序檢測，然后根據(jù)miRNA的表達(dá)豐度定量分析。

2.4.1 克隆測序

克隆測序法是預(yù)測新miRNA最古老的方法之一，此方法要先抽提RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，構(gòu)建miRNA的cDNA文庫，然后把擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體上深度測序。獲得大批量的Raw data序列，與各數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行miRNA的定量檢測，進(jìn)而鑒定新miRNA。

為提高直接克隆的靈敏度，Takada 等[34]建立了新型擴(kuò)增克隆法(miRNA amplification profiling，mRAP)，該法系將miRNA的3′端與接頭相連，然后用與接頭反向互補(bǔ)的引物反轉(zhuǎn)錄。因特定的反轉(zhuǎn)錄酶具有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，一些核苷酸(主要是脫氧胞苷酸dC)會連接到反轉(zhuǎn)錄中的cDNA鏈的3′末端。當(dāng)5′端接頭與cDNA鏈的poly(C)粘性末端退火后，加入一對通用引物即可實現(xiàn)對cDNA的PCR擴(kuò)增。mRAP靈敏度比較高，因此可直接用克隆和測序技術(shù)檢測少量組織中miRNA 的表達(dá)量。Cummins等[35]在基因表達(dá)系列分析(SAGE)技術(shù)的基礎(chǔ)上研發(fā)了檢測效率較高的miRAGE(miRNA SAGE)克隆法，即標(biāo)簽序列克隆。該法先要給miRNA分子連上特定的接頭，以便用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，接頭經(jīng)過酶切后用鏈親和素包被的磁性微球移除，然后按照優(yōu)化了的SAGE法進(jìn)行釋放標(biāo)簽的串聯(lián)、克隆和測序。

克隆測序法可直觀可靠的檢測miRNA表達(dá)，是檢測未知miRNA序列最常用的方法之一，但對低表達(dá)量或組織及細(xì)胞特異性的miRNA較難檢測，且耗樣量大、操作繁瑣等劣勢，如今已逐漸被新的檢測方法所取代。

2.4.2 新一代測序技術(shù)[36]

新一代測序技術(shù)始于1987年ABI公司推出的用于繪制人類基因組圖譜的Sanger法。自2005年以來，新一代高通量測序技術(shù)取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展，目前，運用新一代測序技術(shù)可從轉(zhuǎn)錄組測序水平、small RNA測序水平、降解組測序水平等多角度進(jìn)行功能差異基因表達(dá)、miRNA檢測及遺傳物質(zhì)的全面分析，亦可從基因組水平、轉(zhuǎn)錄組水平、蛋白質(zhì)水平等全方位解析分子生物學(xué)功能，是具遠(yuǎn)大發(fā)展前景的miRNA檢測技術(shù)[37]。

新一代高通量測序技術(shù)首推羅氏公司的454焦磷酸測序技術(shù)、Il-lumina公司的Solexa基因組測序。這兩者都能定性、定量檢測miRNA的基因表達(dá)水平，不僅可檢測已知miRNA長度和序列的微小改變，亦可檢測出miRNA的表達(dá)豐度，也是挖掘新miRNA的重要工具。兩種測序方法在測序原理、數(shù)據(jù)量及數(shù)據(jù)質(zhì)量、成本方面雖有差異，但測序步驟基本相同，主要包括：樣品的制備、模板準(zhǔn)備、測序及成像、small RNA序列組裝和比對等[38]。其中，454測序技術(shù)利用微乳滴PCR進(jìn)行擴(kuò)增，將連接得到的每一片段分別與微球結(jié)合，使微球在含有PCR反應(yīng)體系的油滴中獨立擴(kuò)增。將微球中的雙鏈DNA進(jìn)行變性得到帶有單鏈DNA的微珠，再加入到排列有微升級小孔的檢測板中，對微球上片段進(jìn)行基于焦磷酸鹽的測序。而Solexa測序技術(shù)[39]的原理基于邊合成邊測序，使用橋式PCR來擴(kuò)增，是唯一不采用傳統(tǒng)聚合酶進(jìn)行測序的方法，與前者最大的區(qū)別在于以4種不同熒光基團(tuán)分別標(biāo)記16種寡聚核苷酸片段，加入測序引物進(jìn)行連接反應(yīng)。

454測序技術(shù)因操作簡單且一次測序可檢測到200～300 nt長度序列的優(yōu)勢，在尋找新miRNA和轉(zhuǎn)錄組測序中占據(jù)著重要地位。但此法在進(jìn)行miRNA定量檢測時要依賴一系列的酶，增大了檢測的假陽性。Solexa基因組分析儀在每次引物延伸過程中都會摻入一個堿基，導(dǎo)致基因錯配的幾率加大，但在50 bp讀長范圍內(nèi)，Solexa測序儀的準(zhǔn)確率高達(dá)99%以上，這一特性使之成為與qRT-PCR方法并駕齊驅(qū)的新穎miRNA檢測方法。

2.5 Agilent 2100 Bioanalyzer[40]

Agilent 2100 Bioanalyzer技術(shù)是以生物芯片核酸分析系統(tǒng)(簡稱Bioanalyzer)為原理進(jìn)行miRNA定量檢測，采用高靈敏度的熒光檢測系統(tǒng)可在一定程度上克服瓊脂糖凝膠電泳的局限性和誤差。

Agilent 2100 Bioanalyzer檢測miRNA需先構(gòu)建cDNA文庫，通過特異性引物的介導(dǎo)，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。按照DNA 7500 LabChip試劑盒所提供的說明制備凝膠染料及芯片，將PCR產(chǎn)物加入到芯片樣品孔后，渦旋震蕩放入Agilent 2100 Bioanalyzer中進(jìn)行自動檢測分析。該法在準(zhǔn)確度、重復(fù)性上有獨特的優(yōu)勢，如：①耗時短：在分離管道和高電場的應(yīng)用下，30 min內(nèi)就可完成若干個miRNA的連續(xù)自動化分析；②操作簡便：與瓊脂糖凝膠電泳不同，Agilent 2100 Bioanalyzer無需進(jìn)行凝膠制備、跑電泳、染色、成像等，也不用進(jìn)行繁瑣的數(shù)據(jù)分析；③樣品用量少：以微小樣品消耗量進(jìn)行檢測，可實現(xiàn)miRNA的微量化；⑤安全高效：最大限度地減少危害物質(zhì)的接觸(如EB)，并減少廢物量。鑒于以上優(yōu)點，Agilent 2100 Bioanalyzer芯片分析系統(tǒng)和PCR特異性反應(yīng)結(jié)合，在miRNA的檢測和鑒定中具有巨大的發(fā)展前景。

表1 幾種miRNA檢測方法的特點及靈敏度Table 1 Characteristics and sensitivity of several miRNA detection methods

3 小結(jié)與展望

建立理想的miRNA定量檢測分析方法，將有助于研究miRNA的高度保守性、時空特異性等生物學(xué)功能，使得miRNA為疾病診斷和生物醫(yī)藥制劑的研發(fā)帶來新契機(jī)。目前，miRNA定量檢測方法的建立主要依賴各種探針設(shè)計和標(biāo)記技術(shù)，與微陣列芯片、實時熒光定量PCR、高通量測序等技術(shù)聯(lián)用來提高檢測靈敏度和特異性。隨著Q-PCR分析服務(wù)的可靠和直觀性，越來越多的研究者選用此法進(jìn)行miRNA表達(dá)水平的驗證分析，同時，新一代測序技術(shù)成本不斷降低，運用測序分析儀進(jìn)行miRNA高通量建庫檢測技術(shù)迅速發(fā)展，近年建立起以調(diào)控基因表達(dá)的靶mRNA或以miRNA為檢測疾病的構(gòu)想，已成為未來研發(fā)的熱點。與傳統(tǒng)的miRNA檢測方法相比，新一代測序技術(shù)、RCA等檢測方法憑借高通量、高質(zhì)量、高準(zhǔn)確度、可重復(fù)性等優(yōu)勢，普遍應(yīng)用于新 miRNA預(yù)測、篩選差異表達(dá)功能基因、miRNA靶基因的預(yù)測及miRNA異構(gòu)體檢測等方面。但每種方法也有不可忽略的缺陷，故往往要根據(jù)實驗?zāi)康募皺z測方法的優(yōu)劣勢或多種方法聯(lián)用以選擇合適的miRNA檢測方法。相信隨著轉(zhuǎn)錄組測序、small RNA測序、降解組測序及蛋白基因組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，大規(guī)模的miRNA定量檢測技術(shù)將會更廣泛地應(yīng)用在分子生物學(xué)研究中。

[1] DONG Haifeng,LEI Jianping,DING Lin,et al. MicroRNA:function,detection,and bioanalysis[J]. Chem Rev,2013,113(8):6207-6233.

[2] LIU Suling,CLOUTHIER S G,WICHA M S. Role of microRNAs in the regulation of breast cancer stem cell[J]. J Mammary Gland Biol Neoplasia,2012,17(1):15-21.

[3] SRIVASTAVA K,SRIVASTAVA A. Comprehensive review of genetic association studies and meta-analyses on miRNA polymorphisms and cancer risk[J]. Plos One,2012,7 (11):e50966.

[4] MO M H,CHEN Liang,FU Yebo,et al. Cell-free Cir culating miRNA Biomarkers in cancer [J]. J Cancer,2012,3:432-448.

[5] JUNG M,SCHAEFER A,STEINER I,et al.Robust microRNA stability in degraded RNA preparations from human tissue and cell samples[J]. Clin Chem,2010.56(6):998-1006.

[6] DRUMMOND M J,MCCARTHY J J,SINHA M,et al. Aging and microRNA expression in human skeletal muscle:a microarray and bioinformatics analysis[J]. Physiol Genomics,2011,43(10):595-603.

[7] CLOONAN N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions:intertwining issues confound target discovery[J]. Bioessays,2015,37(4):379-388.

[8] LI Ronghong,LI Xiang,NING Shangwei,et al. Identification of a core miRNA-pathway regulatory network in glioma by therapeutically targeting miR-181d,miR-21,miR-23b,β-Catenin,CBP,and STAT3[J]. Plos One,2014,9(7):e101903.

[9] DE PLANELL-SAGUER M,RODICIO M C. Detection methods for microRNA in clinic practice[J]. Clinic Biochem,2013,46(10/11):869-878.

[10] BENES V,CASTOLDI M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR,how to use it and what is available[J]. Methods,2010,50(4):244-249.

[11] SHEN Yanting,TIAN Fei,CHEN Zhenzhu,et al. Amplification-based method for microRNA detection[J]. Biosens Bioelectron,2015,71:322-331.

[12] TORRES A G,FABANI M M,VIGORITO E,et al. MicroRNA fate upon targeting with anti-miRNA oligonucleotides as revealed by an improved Northern-blot-based method for miRNA detection[J]. RNA,2011,17(5):933-943.

[13] 王穎芳,王宇亮,韓彬,等.人參中miRNA的提取和鑒定分析[J]. 實用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2012,26(8):7-8.

[14] OUELLET D L,PLANTE I,LANDRY P,et al. Identification of functional microRNAs released through asymmetrical processing of HIV-1 TAR element[J]. Nucleic Acids Res,2008,36(7):2353-2365.

[15] ARATA H,KOMATSU H,HAN A,et al. Rapid microRNA detection using power-free microfluidic chip:coaxial stacking effect enhances the sandwich hybridization[J]. Analyst,2012,137(14):3234-3237.

[16] WANG Bin,XI Yaguang. Challenges for MicroRNA Microarray Data Analysis[J]. Microarrays,2013,2(2):34-50.

[17] SATO F,TSUCHIYA S,TERASAWA K,et al. Intra-platform repeatability and inter-platform comparability of microRNA microarray technology[J]. PLoS One,2009,4(5):e5540.

[18] REICHENSTEIN I,AIZENBERG N,GOSHEN M,et al. A novel qPCR assay for viral encoded microRNAs[J]. J Virol Methods,2010,163(2):323-328.

[19] 李珊珊,付漢江,鐵軼,等.ploy(U)加尾microRNA檢測方法建立及其檢測[J]. 軍事醫(yī)學(xué),2013,37(7):547-549.

[20] VANCE S A,SANDROS M G. Zeptomole detection of C-reactive protein in serum by a nanoparticle amplified surface plasmon resonance imaging aptasensor[J]. Sci Rep,2014,4:5129.

[21] YIN Huanshun,ZHOU Yunlei,ZHANG Haixia,et al. Electro- chemical determination of microRNA-21 based on graphene,LNA integrated molecular beacon,AuNPs and biotin multifunctional bio bar codes and enzymatic assay system[J]. Biosens Bioelectron,2012,33(1):247-253.

[22] DONG Haifeng,HAO Kaihong,TIAN Yaping,et al. Label-free and ultrasensitive microRNA detection based on novel molecular beacon binding readout and target recycling amplification[J]. Biosens Bioelectron,2014,53:377-383.

[23] ALHASAN A H,KIM D Y,DANIEL W L,et al. Scanometric microRNA array profiling of prostate cancer markers using spherical nucleic acid-gold nanoparticle conjugates[J]. Anal Chem,2012,84(9):4153-4160.

[24] KOBORI T,TAKAHASHI H. Expanding possibilities of rolling circle amplification as a biosensing platform[J]. Anal Sci,2014,30(1):59-64.

[25] JONSTRUP S P,KOCH J,KJEMS J. A microRNA detection system based on padlock probes and rolling circle amplification[J]. RNA,2006,12(9):1747-1752.

[26] CUI Liang,ZHU Zhi,LIN Ningmin,et al. A T7 exonuclease-assisted cyclic enzymatic amplification method coupled with rolling circle amplification:a dual-amplification strategy for sensitive and selective microRNA detection[J]. Chem Commun,2014,50(13):1576-1578.

[27] GE Jia,ZHANG Liangliang,LIU Sijia,et al. A highly sensitive target-primed rolling circle amplification (TPRCA) method for fluorescent in situ hybridization detection of microRNA in tumor cells[J]. Anal Chem,2014,86(3):1808-1814.

[28] WEN Yanqin,XU Yan,MAO Xiuhai,et al. DNAzyme-based rolling-circle amplification DNA machine for ultrasensitive analysis of microRNA in Drosophila larva[J]. Anal Chem,2012,84(18):7664-7669.

[29] LIU Haiyun,LI Lu,DUAN Lili. High specific and ultrasensitive isothermal detection of microRNA by padlock probe-based exponential rolling circle amplification[J]. Anal Chem,2013,85(16):7941-7947.

[30] POHLMANN C,SPRINZL M. Electrochemical detection of microRNAs via gap hybridization assay[J]. Anal Chem,2010,82(11):4434-4440.

[31] LIN Meihua,WEN Yanli,LI Lanying,et al. Target-responsive,DNA nanostructure-based E-DNA sensor for microRNA analysis[J]. Anal Chem,2014,86(5):2285-2288.

[32] DENG Huimin,SHEN Wei,REN Yuqian,et al. A highly sensitive and selective homogenous assay for profiling microRNA expression[J]. Biosens Bioelectron,2014,54:650-655.

[33] KOZOMARA A,GRIFFITHS-JONES S. miRBase:annotating high confidence microRNA using deep sequencing data[J]. Nucleic Acids Res,2014,42:D68-D73.

[34] TAKADA S,BEREZIKOV E,YAMASHITA Y,et al.Mouse microRNA profiles determined with a new and sensitive cloning method[J]. Nucleic Acids Res,2006,34 (17):e115.

[35] CUMMINS J M,HE Yiping,LEARY R J,et al. The colorectal microRNAome[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(10):3687-3692.

[36] 湯海明,陳紅,張靜,等.新一代測序技術(shù)應(yīng)用于microRNA檢測[J].技術(shù)與方法,2012,34(6):784-792.

[37] 吳望軍,陳杰,黃瑞華,等.高通量技術(shù)挖掘豬microRNA的研究進(jìn)展[J]. 2013,44(12):1857-1866.

[38] 岳桂東,高強(qiáng),羅龍海,等.高通量測序技術(shù)在動植物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用[J]. 中國科學(xué):生命科學(xué),2012,42(2):107-124.

[39] 杜玲,劉剛,陸建,等.高通量測序技術(shù)的發(fā)展及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用[J]. 中國畜牧獸醫(yī),2014,41(12):109-115.

[40] 景建洲,趙培培,王博飛.利用Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測食源性致病志賀氏菌[J]. 食品安全與檢測,2010,35(1):293-296.

(責(zé)任編輯：王昌棟)

Current research in methods for the quantitative detection of microRNA

CHEN Yanlin,WANG Yingfang

(SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

MicroRNA(miRNA) is a kind of non-coding endogenous small molecule RNA,which is composed of 18-24 nt nucleic acid. It is mainly involved in the regulation of cell differentiation,proliferation and apoptosis. Mature miRNA sequence is short,highly conservative,stability and other characteristics,which increases a lot of difficulties for accurate detection of miRNA levels. miRNA quantitative detection principle is mainly based on nucleic acid hybridization or amplification,including Northern bloting,microarray chip,real-time quantitative PCR,rolling ring amplification,etc. Through the analysis of the advantages and disadvantages of the existing miRNA detection technology in recent years,this paper will provide a reference for screening suitable miRNA quantitative detection method.

microRNA; quantitative PCR; rolling ring amplification; Northern bloting

2016-08-24

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(81403195);廣東省自然科學(xué)基金項目(S2013010015418)

陳艷琳(1991—),女,2014級碩士研究生,Email:944589543@qq.com；通信作者：王穎芳(1975—),女,副教授,從事中藥方劑學(xué)研究，Email:150306757@qq.com。

時間：2016-10-08 11:45

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161008.1145.003.html

Q522

A

1006-8783(2016)05-0666-06

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016082402