劉來兵， 劉　健，**， 出良釗，， 楊　華，， 李玉美

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)　550014； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察*

劉來兵1， 劉健1，2**， 出良釗1，2， 楊華1，2， 李玉美2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)550014； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 探討人腦膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法。方法： 手術(shù)切除腦膠質(zhì)瘤患者的病灶組織，采用機(jī)械分離胰酶消化法獲取膠質(zhì)瘤細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，通過差速貼壁、反復(fù)傳代、自然純化法獲得純度高、生物性狀穩(wěn)定、增殖能力強(qiáng)的細(xì)胞株，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，免疫組織化學(xué)技術(shù)鑒定原代細(xì)胞及其純度。結(jié)果： 培養(yǎng)成功的原代細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)好，有明顯的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；惡性程度越高細(xì)胞增殖越快，可傳代培養(yǎng)，膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)染色陽(yáng)性率達(dá)93%，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為純度較高的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。結(jié)論： 機(jī)械分離胰酶消化法適合于體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)。

[關(guān)鍵詞]神經(jīng)膠質(zhì)瘤； 胰酶; 消化; 細(xì)胞培養(yǎng); 生長(zhǎng)曲線; 免疫組織化學(xué)

腦膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的惡性腫瘤，在成人的發(fā)病率約為6/10萬(wàn)，5年生存率20%～30%[1-3]。部分腦膠質(zhì)瘤惡性程度高，生存期短。原代細(xì)胞剛從腫瘤組織中分離出來，包含了腫瘤細(xì)胞的各種信號(hào)，生物學(xué)特性沒有發(fā)生很大的變化，仍保留原來的遺傳學(xué)特性，這樣培養(yǎng)出的腫瘤細(xì)胞與在體腫瘤細(xì)胞的真實(shí)狀態(tài)最接近, 是研究抗腫瘤藥物作用機(jī)制及腫瘤基因表達(dá)的理想細(xì)胞模型[4]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來源

收集2011年10月～2012年3月15例腦膠質(zhì)瘤患者新鮮手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，所取標(biāo)本征得患者或家屬的知情同意，所有標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理檢查確診。其中男9例，女6例，22～67歲，平均45.2歲。按WHO(2007)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[5]：星形細(xì)胞瘤6例(Ⅱ級(jí))，間變形星形細(xì)胞瘤6例(Ⅲ級(jí))，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤3例(Ⅳ)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)，DMEM/F12(Hyclone公司)，鼠抗人GFAP(武漢博士德)，SABC試劑盒(北京中杉金橋)等。

1.2方法

1.2.1原代細(xì)胞培養(yǎng)將手術(shù)切除的新鮮腫瘤標(biāo)本(選擇腫瘤細(xì)胞豐富的實(shí)質(zhì), 避開與正常組織交界區(qū)、鈣化處、出血、壞死液化區(qū))放入含雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液的瓶中，冰浴下立即送實(shí)驗(yàn)室；鏡下選取較單純的腫瘤組織(剔除壞死組織和血管等組織)，眼科剪剪成約1 mm3小塊，研磨約1 min，滴加適量的胰酶-EDTA(0.02%EDTA及0.25%胰蛋白酶)37 ℃消化5 min，終止消化后用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞盡量分散，用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾；過濾后的懸液離心、重懸，按5×104/mL接種于50 mL的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)30 min后，將細(xì)胞懸液移至另一培養(yǎng)瓶中，去除成纖維細(xì)胞，48 h后更換培養(yǎng)液，棄除未貼壁細(xì)胞，以后每3 d換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察不同時(shí)期細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并照相。

1.2.2傳代及純化細(xì)胞細(xì)胞融合達(dá)80%～90%后，滴加胰酶-EDTA(0.02%EDTA及0.25%胰蛋白酶)37℃消化，當(dāng)觀察到細(xì)胞突起回縮、形態(tài)變圓、細(xì)胞間隙變大，約有80%細(xì)胞漂浮時(shí)，加入等體積的含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中止消化；按1∶2傳代，經(jīng)多次傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，使細(xì)胞逐漸得到純化和擴(kuò)增。

1.2.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定取已鋪滿培養(yǎng)瓶底的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，消化后以5×104個(gè)/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板。每24 h取3孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)7 d，以細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。按Patterson 公式計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間為：Td=tlg 2/lg(Nt/No)，其中Td為倍增時(shí)間(h)，t為細(xì)胞數(shù)由No增至Nt所需的時(shí)間，No為接種時(shí)的細(xì)胞數(shù)，Nt為培養(yǎng)t h后的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4鑒定腫瘤細(xì)胞收獲P3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞， 4%多聚甲醛液固定，滴加相應(yīng)的GFAP一抗(滴度1∶100)，4 ℃過夜，滴加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，脫水，透明，中性樹膠封片，在高倍鏡下(400×)隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞所占的百分率。

2結(jié)果

2.1人膠質(zhì)瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞

接種后48 h換液，去除不貼壁的細(xì)胞和碎片后，鏡下可見單個(gè)分散或數(shù)個(gè)克隆樣貼壁的細(xì)胞，形態(tài)較為均勻，呈棱形伸展?fàn)顟B(tài)或多邊形，以棱形細(xì)胞為主(圖1A)；第3天可觀察到貼壁細(xì)胞有分裂增殖，細(xì)胞數(shù)目增加明顯，腫瘤細(xì)胞形態(tài)多樣，呈棱形、三角形、多角形等，細(xì)胞輪廓清晰(圖1B)。4～5 d原代培養(yǎng)的細(xì)胞逐漸形成分散的細(xì)胞集落(圖1C)，于培養(yǎng)6～7 d天漸漸鋪滿培養(yǎng)瓶底，細(xì)胞達(dá)90%融合(圖1D)，呈鋪路石樣排列，惡性程度越高細(xì)胞增殖越快。

2.2傳代及純化細(xì)胞

培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)90%左右融合時(shí)，消化傳代。傳代的細(xì)胞形態(tài)與原代相似，傳代細(xì)胞生長(zhǎng)潛伏期短，接種2～3 h后即貼壁伸展，逐漸恢復(fù)為棱形，12～24 h完全貼壁，傳代后的細(xì)胞增殖速度較快， 3～5 d即可傳代1次，且細(xì)胞形態(tài)單一均勻，呈鋪路石樣排列(圖2A、2B)。

2.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

生長(zhǎng)曲線顯示細(xì)胞接種第2天后細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第3～5天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)第7天細(xì)胞增殖達(dá)到高峰，第7天后細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期，見圖3。

2.4第3代人膠質(zhì)瘤細(xì)胞鑒定

注：A 為培養(yǎng)48 h(200×),B為培養(yǎng)第3天(200×),C為培養(yǎng)第5天(200×),D為培養(yǎng)第7天(100×)圖1　原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞Fig.1　Primary cultured glioma cells

注：A為第3代培養(yǎng)第2天(200×),B為第3代培養(yǎng)第5天(100×)圖2　傳代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞Fig.2　Subcultured glioma cells

圖3　膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖Fig.3　The glioma cell growth curve

原代培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)純化傳代至第3代時(shí)，絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)染色陽(yáng)性，細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒，陽(yáng)性率達(dá)93%，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為膠質(zhì)瘤細(xì)胞(圖4A、B)。

注：A、B分別為第3代培養(yǎng)第5天細(xì)胞GFAP的表達(dá)(SABC×100，×400)圖4　第3代人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的GFAP表達(dá)Fig.4　The GFAP expression of the third generation cells cultured for 5 days

3討論

腦膠質(zhì)瘤是顱腦腫瘤中最常見的一種，嚴(yán)重危害患者的健康。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)是直接取患者的腫瘤組織在體外進(jìn)行擴(kuò)增、培養(yǎng)，因剛從組織中分離，其生物學(xué)特性還未發(fā)生很大的變化，仍保留原來的遺傳學(xué)特性，也最接近體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性[6],適用于藥物敏感試驗(yàn)、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于膠質(zhì)瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)的研究[7-8],腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)在膠質(zhì)瘤研究的各個(gè)領(lǐng)域均得到廣泛的應(yīng)用。

原代細(xì)胞培養(yǎng)方法有酶消化法和組織塊培養(yǎng)法，對(duì)方法的選擇很多學(xué)者持有不同的觀點(diǎn)[9]。本實(shí)驗(yàn)先用研磨器研磨機(jī)械分離細(xì)胞，再加入胰酶短時(shí)間消化，不銹鋼濾網(wǎng)過濾進(jìn)行體外培養(yǎng)，這樣既避開了單純酶消化法步驟多、組織需要量大的缺點(diǎn), 還可以減輕長(zhǎng)時(shí)間酶消化時(shí)對(duì)原代細(xì)胞的損傷作用；同時(shí)也摒棄了組織塊培養(yǎng)法細(xì)胞周期很長(zhǎng)、成功率低等缺點(diǎn)，很適合目前的科學(xué)研究的需要。

大量研究證實(shí)GFAP是一種由膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)的中間絲細(xì)胞骨架蛋白，決定膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[10]。細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化與細(xì)胞的形態(tài)改變密切相關(guān)，細(xì)胞形態(tài)一旦改變?cè)摷?xì)胞的生長(zhǎng)特性與功能必發(fā)生改變。決定細(xì)胞形態(tài)的物質(zhì)主要與細(xì)胞骨架有關(guān)。真核生物細(xì)胞的骨架主要由肌動(dòng)蛋白、微絲及介于兩者之間的中間絲三類網(wǎng)狀蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中以中間絲變異高，并顯示出特異性的表達(dá)。目前GFAP是最常用于識(shí)別正常或病理情況下膠質(zhì)細(xì)胞來源的一種特異性的蛋白質(zhì)[11]。本實(shí)驗(yàn)在倒置顯微鏡下觀察到體外原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)多樣，有梭形、三角形、多角形，以棱形為主，這與眾多文獻(xiàn)報(bào)告的原代膠質(zhì)瘤細(xì)胞的形態(tài)相符，且通過傳代的純化，細(xì)胞形態(tài)逐漸均勻、單一，以棱形為主。選用第3代細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好的膠質(zhì)瘤細(xì)胞采用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞特異性的標(biāo)志物GFAP的表達(dá)，結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞高度表達(dá)GFAP，胞質(zhì)染成棕黃色，陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)93%，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為膠質(zhì)瘤細(xì)胞，且純度較高。

本實(shí)驗(yàn)采用機(jī)械分離胰酶消化法成功培養(yǎng)出人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，為下一步深入研究膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性及體外藥物敏感性試驗(yàn)、動(dòng)物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)等奠定了基礎(chǔ)。

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(2015-09-27收稿，2015-11-05修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

Culture of Primary Human Glioma Cellsinvitroand Morphological Observation

LIU Laibing1, LIU Jian1，2, CHU Liangzhao1，2, YANG Hua1，2, LI Yumei2

(1.AffiliatedBaiyunHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550014,Guizhou,China;2.GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To probe the method of culturing primary human glioma cells in vitro. Methods: Glioma cells were obtained by mechanical separation and enzymatic digestion of glioma patients' focus tissue removed by surgical resection. The morphological changes of these glioma cells were observed under inverted microscope. The cell lines of high purity, biological traits stability, strong capacity of proliferation were obtained by differential speed stick wall, repeated passaging and natural purification. The cell growth curve was drawn and immunohistochemical technique was adopted to identify the primary cells and their purity. Results: The primary cells that were cultured successfully showed a good growing status of adhering to wall, apparent logarithmic growth period. The higher malignant degree of primary cells, the faster the proliferation. Those cells could be subcultured. The positive staining rate of glial fibrillar acidic protein (GFAP) was up to 93%, proving the cultured cells were glioma cells of high purity. Conclusion: The human glioma cells can be cultured by mechanical separation and enzymatic digestion.

[Key words]glioma cells; pancreatin; digestion; cell culture; growth curve; immunohistochemistry

[中圖分類號(hào)]R739.41

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)01-0024-03

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81560409)；貴陽(yáng)市社會(huì)發(fā)展與民生科技計(jì)劃[筑科合同(2012)103.39號(hào)]；貴州省科技局聯(lián)合基金[黔科合LG字(2012)069號(hào)]； 教育部“創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”[國(guó)家教育部科技司(教技涵509-IRT13058)]

**通信作者 E-mail:136721361@qq.com網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160107.2042.050.html