張旺德， 趙孝梅， 刁曉艷， 何　燕*， 官志忠

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 心血管內(nèi)科， 貴州 貴陽　550004)

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內(nèi)皮型一氧化氮合成酶基因rs3918181位點(diǎn)多態(tài)性與貴州漢族原發(fā)性高血壓的關(guān)系*

張旺德1**， 趙孝梅1， 刁曉艷2， 何燕1***， 官志忠1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 心血管內(nèi)科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討貴州省漢族人群內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因第14內(nèi)含子rs3918181位點(diǎn)多態(tài)性與原發(fā)性高血壓(EH)的關(guān)系。方法： 選取貴州漢族人群的原發(fā)性高血壓患者169例和健康對照者164例，應(yīng)用TaqMan探針法對eNOS基因rs3918181位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，分析不同基因型與EH發(fā)病關(guān)系。結(jié)果： EH組患者的AA、AG和GG基因型頻率分別為0.095、0.426和0.479，對照組分別為0.104、0.408和0.488，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；EH組A與G等位基因頻率分別為0.308和0.692，對照組分別為0.308和0.692，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論： eNOS基因rs3918181位點(diǎn)多態(tài)性與貴州省漢族原發(fā)性高血壓可能無關(guān)。

[關(guān)鍵詞]高血壓； 一氧化氮合酶； 基因多態(tài)性； 等位基因； 基因型； 漢族； 貴州

原發(fā)性高血壓(essential hypertension, EH)是多基因遺傳病，受遺傳和環(huán)境因素的共同作用，但遺傳因素起著重要作用，因此從基因水平探討EH的發(fā)病機(jī)制是重要的研究方向[1]。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因多態(tài)性與高血壓有密切關(guān)系，被認(rèn)為是高血壓的重要候選基因[2]。本研究旨在探討eNOS基因rs3918181位點(diǎn)多態(tài)性與貴州省漢族人群EH的關(guān)系。

1對象與方法

1.1研究對象

選擇2014年3月～2015年3月在心內(nèi)科門診及住院部就診的高血壓患者169例為EH組，按2010年中國高血壓防治指南的標(biāo)準(zhǔn)診斷；排除繼發(fā)性高血壓、心肌病、瓣膜疾病、先天性心臟病及肝、腎衰竭，孕婦、哺乳期婦女以及精神疾病史或?yàn)E用藥物者，EH組男性75例，女性94例，平均(58.08±11.29)歲。另選健康體檢者共164例，其中男75例，女89例，平均年齡(55.84±10.51)歲，無高血壓家族史，無各類心血管、腦血管、腎、內(nèi)分泌等方面疾病。兩組研究對象在性別、年齡構(gòu)成上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩組均為貴州籍漢族人，相互間均無血緣關(guān)系。

1.2方法

1.2.1血壓測定采用校正的水銀柱式血壓計(刻度以2 mmHg為單位)于上午10∶00～12∶00測定血壓；測血壓前30 min 內(nèi)禁止吸煙和飲咖啡，避免勞累、緊張和興奮，靜坐5 min，裸露右側(cè)上臂，肱動脈置于和心臟同一水平線位置，每次重復(fù)測量3 次，測量相隔5 min/次，取3 次測量的平均值，由專人使用相同血壓計測量。

1.2.2基因組DNA的提取實(shí)驗(yàn)前夜禁食12 h以上，次晨抽取空腹肘靜脈血液標(biāo)本5 mL，用EDTA抗凝管；按經(jīng)典常規(guī)法(酚-氯仿法)抽提白細(xì)胞DNA，溶于TE；紫外吸收法定量后標(biāo)化模板為30 g/L，-40 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3基因分型應(yīng)用TaqMan 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對eNOS基因rs3918181位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。PCR反應(yīng)體系為10 μL：模板DNA 1.5 μL，通用TaqMan PCR Master Mix 5 μL，20×Assay Working Stock 0.25 μL，加ddH2O補(bǔ)足10 μL。TaqMan PCR Master Mix、20×Assay Working Stock均購自美國ABI公司，內(nèi)含的兩個探針分別用VIC、FAM染料標(biāo)記。反應(yīng)條件為：60 ℃ 30 s，95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60℃ 1 min 20 s，共55個循環(huán)，60 ℃ 30 s，儀器采用美國AB公司生產(chǎn)的Step One Plus 實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)，讀取VIC/FAM熒光判斷基因分析結(jié)果。VIC熒光探針識別A等位基因，F(xiàn)AM熒光探針識別G等位基因。每塊96孔板設(shè)3孔陰性對照，并隨機(jī)抽取5%樣本復(fù)測，一致性為100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件。研究對象的Hardy-weinberg平衡符合程度、組間基因型、等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。兩組計量資料組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1基因型分布的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EH組和對照組人群eNOS基因rs3918181位點(diǎn)均存在A和G等位基因，有AA純、AG雜合、GG純3種基因型，見圖1。兩組的基因型頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)，見表1。

注：紅點(diǎn)、綠點(diǎn)、藍(lán)點(diǎn)分別為rs3918181位點(diǎn)AA野生純合型、AG雜合型、GG純合突變型，黑色方塊代表空白對照(NTC)圖1　人基因組rs3918181 (eNOS) 位點(diǎn)TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR分型Fig.1　The genotyping results of rs3918181 (eNOS) SNP loci by using TaqMan probe real-time quantitative PCR

2.2基因型和等位基因頻率分布

經(jīng)χ2檢驗(yàn)兩組基因型頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.141，P>0.05)，兩組等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.000，P>0.05)，見表1。

表1　兩組被檢者eNOS基因rs3918181位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布

3討論

eNOS基因在人類染色體上位于7q35-q36，全長約21 kb，包含26個外顯子和25個內(nèi)含子，其編碼的mRNA可翻譯生成1 203個氨基酸[3]。eNOS的作用是催化血管內(nèi)皮左旋精氨酸和氧分子經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)生成一氧化氮(NO)，內(nèi)皮來源的NO是調(diào)節(jié)血壓和維持正常血流的重要分子[4]；研究表明人體內(nèi)源性NO的持續(xù)生成主要由eNOS調(diào)節(jié)，因此eNOS基因序列的多態(tài)性通過影響eNOS的功能而影響人體內(nèi)NO的濃度[5]。Bonnardeaux[6]等研究顯示，eNOS的表達(dá)異常或eNOS的活性降低，NO的合成就會減少，引起機(jī)體的外周血管阻力增加，血壓就會升高。故eNOS基因已成為高血壓病的候選基因之一。

目前國內(nèi)外關(guān)于eNOS基因多態(tài)性與EH關(guān)系研究多集中于第7外顯子894位點(diǎn)[7-9]、啟動子區(qū)786位點(diǎn)[10-12]以及第4內(nèi)含子[13-15]，對第14內(nèi)含子的研究相對較少，但所得結(jié)論都仍有爭議。許多位于基因功能未知的區(qū)域或非編碼區(qū)的遺傳標(biāo)記與疾病相關(guān)，內(nèi)含子是基因組中重要的調(diào)控元件,可以直接對基因的表達(dá)起調(diào)控作用，也可通過自身的剪接影響基因的表達(dá)。高鵬等[16]對eNOS基因14內(nèi)含子rs3918181位點(diǎn)多態(tài)性與腦卒中合并高血壓關(guān)系的研究結(jié)果表明，eNOS基因rs3918181位點(diǎn)多態(tài)性可能與高血壓的發(fā)生有關(guān)。閆雪等[17]對天津漢族290例EH患者和161名健康對照者的eNOS基因rs3918181位點(diǎn)多態(tài)性與EH的關(guān)系的研究結(jié)果顯示，EH組患者AA、AG和GG基因型分布頻率分別為0.293、0.393和0.314，A與G等位基因頻率分別為0.490和0.510，與對照組相比基因型分布頻率及等位基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，eNOS基因rs3918181位點(diǎn)多態(tài)性與EH相關(guān)。而關(guān)于eNOS基因rs3918181位點(diǎn)多態(tài)性與貴州地區(qū)漢族人群EH的關(guān)系研究至今尚未見報道。因此，本研究選取第14內(nèi)含子rs3918181位點(diǎn)對貴州漢族人群的EH患者169例和健康對照者164例進(jìn)行研究分析，結(jié)果顯示EH組患者的AA、AG和GG基因型分布頻率分別為0.095、0.426和0.479，A與G等位基因頻率分別為0.308和0.692，與對照組相比基因型分布頻率及等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明eNOS基因rs3918181位點(diǎn)多態(tài)性與貴州漢族EH可能不相關(guān)。這與高鵬等[16]和閆雪等[17]的研究結(jié)果相反。而與楊波等[18-19]研究結(jié)果一致。以上研究結(jié)果間存在差異的可能原因：(1)研究方法及樣本來源不同；(2)研究對象的遺傳背景及基因多態(tài)性位點(diǎn)的作用強(qiáng)度不同；(3)生活習(xí)慣及居住環(huán)境不同。

總之，本研究結(jié)果提示eNOS基因rs3918181位點(diǎn)多態(tài)性與貴州漢族人群中EH可能無關(guān)，但本研究的樣本量較小，容易產(chǎn)生統(tǒng)計偏差，仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以證實(shí)。

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(2015-10-08收稿，2015-11-30修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

Relationship between Rs3918181 Polymorphism of Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene and Essential Hypertension of Han Population in Guizhou

ZHANG Wangde1， ZHAO Xiaomei1， DIAO Xiaoyan2， HE Yan1， GUAN Zhizhong1

(1.KeyLaboratoryofMolecularBiology，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，Guizhou，China；2.InternalMedicine-

CardiovascularDepartment，AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，Guizhou，China)

[Abstract]Objective: To investigate the relationship between intron 14 th rs3918181 locus polymorphism of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene and essential hypertension (EH) in Han population of Guizhou Province. Methods: TaqMan probe method was adopted to analyse the rs3918181 polymorphism genotype of eNOS gene in 169 cases with EH and 164 cases of normal control group. Then the relationship between different genotypes and EH were explored. Results: The frequencies of AA, AG and GG genotypes were 0.095, 0.426 and 0.479 in EH group respectively, while the frequencies of AA, AG and GG genotypes were 0.104, 0.408 and 0.488 in control group respectively. There was no significant difference in frequencies of genotype distribution between two groups (P>0.05). The frequencies of A and G alleles were 0.308, 0.692 in EH group, and 0.308, 0.692 in control group. There was no significant difference in frequencies of allele distribution between two groups (P>0.05). Conclusions: The genetic polymorphism of rs3918181 locus in eNOS gene may not be associated with EH susceptibility in Han population of Guizhou Province.

[Key words]hypertension; nitric oxide synthase; genetic polymorphism; alleles; genotype; han population; Guizhou

[中圖分類號]R342; R544.11

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)01-0008-04

*[基金項(xiàng)目]國家科技支撐計劃項(xiàng)目(2013BAI05B03)； 貴州省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”[黔教合協(xié)同創(chuàng)新中心(2014)06號]

**貴州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院2014級碩士研究生

***通信作者 E-mail:annieheyan@gmc.edu.cn網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160107.1825.008.html