徐國(guó)強(qiáng), 黃小瓊, 孫達(dá)權(quán), 王　偉, 陳騰祥

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550025)

?

肝星形細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)肝癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響*

徐國(guó)強(qiáng)1**, 黃小瓊1, 孫達(dá)權(quán)2, 王偉1, 陳騰祥1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng)550025)

[摘要]目的： 探討人肝星形細(xì)胞條件培養(yǎng)液(HSC-CM)對(duì)肝癌細(xì)胞(HCC)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。方法： 采用HSC-CM培養(yǎng)肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HSC-CM對(duì)SMMC-7721遷移和侵襲的影響，激光共聚焦顯微術(shù)(LSCM)和Western blot分析CM培養(yǎng)下SMMC-7721中上皮標(biāo)志物E-cadherin、間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)變化，Western blot檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)水平。結(jié)果： HSC-CM培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)，和常規(guī)培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SMMC-7721上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)、間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)，核轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)上調(diào)，與常規(guī)培養(yǎng)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： HSC-CM促進(jìn)了SMMC-7721的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

[關(guān)鍵詞]癌，肝細(xì)胞； 星形細(xì)胞； 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化； 細(xì)胞培養(yǎng)； 培養(yǎng)基，條件性

肝癌轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)(metastasis and invasion)是術(shù)后高復(fù)發(fā)和5年存活率低下的主要原因，肝癌細(xì)胞(hepatoma carcinoma cells，HCC )發(fā)生侵襲的基礎(chǔ)是癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)[1-2]。HCC發(fā)生EMT是內(nèi)因和外因共同作用的結(jié)果，內(nèi)因主要包括肝癌細(xì)胞自身基因突變或者基因表達(dá)紊亂而引起胞內(nèi)正常蛋白組學(xué)發(fā)生改變，進(jìn)而影響細(xì)胞生物學(xué)特性和行為[3-4]；外因主要是指肝癌細(xì)胞生存的微環(huán)境(tumor microenvironment)發(fā)生變化，包括細(xì)胞外基質(zhì)、胞外體液pH值、激素、細(xì)胞因子等各種生物信號(hào)小分子的改變[5-7]。改變肝癌細(xì)胞生存微環(huán)境，可以延緩甚至抑制肝癌細(xì)胞惡化及侵襲。肝癌細(xì)胞微環(huán)境可分為非細(xì)胞組分和細(xì)胞組分兩大類：非細(xì)胞組分主要包括肝癌細(xì)胞本身與多種癌旁細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)以及體循環(huán)運(yùn)輸而來(lái)的激素等；細(xì)胞組分主要包括肝星形細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、枯否式細(xì)胞、T細(xì)胞等；其中肝星形細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)在肝癌微環(huán)境中起著十分重要的調(diào)控作用[6]。HSC在正常的肝組織中處于靜息狀態(tài)[8]。肝臟一旦受到炎癥、化學(xué)、病理因素等侵襲時(shí)會(huì)使HSC發(fā)生活化，分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子和胞外基質(zhì)，影響細(xì)胞外基質(zhì)的代謝，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)[9-12]。HSC與肝癌細(xì)胞之間進(jìn)行雙向調(diào)控，活化的HSC誘導(dǎo)肝癌發(fā)生EMT及其侵襲，肝癌細(xì)胞又作用于HSC使其進(jìn)一步活化和促進(jìn)其旁分泌，進(jìn)而加劇肝癌惡化[13]。本實(shí)驗(yàn)主要研究肝星形細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，為尋找和阻斷肝癌轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)提供可能靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1材料和設(shè)備

人肝星形細(xì)胞LX2購(gòu)于香港大學(xué)臨床實(shí)驗(yàn)中心，人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)，Transwell小室購(gòu)自Millipore公司，兔抗人E-cadherin抗體，N-cadherin抗體，Vimentin抗體，SNAI 1(A242)抗體均系多克隆抗體(Bioworld公司,1∶500稀釋)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(Bioworlde公司，1∶10 000稀釋)。電泳儀及微型垂直電泳槽購(gòu)于美國(guó) GE公司，GBOXiChemiXR化學(xué)發(fā)光及凝膠成像儀購(gòu)于美國(guó) Syngene公司，F(xiàn)V1000 激光共聚焦掃描顯微鏡、倒置熒光顯微鏡購(gòu)于奧林巴斯公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于美國(guó) Beckman 公司。

1.2肝星形細(xì)胞及SMMC-7721的培養(yǎng)

SMMC-7721培養(yǎng)用添加10% FBS(GIBCO公司)的DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)；肝星形細(xì)胞用添加10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況2～3 d更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)或細(xì)胞傳代培養(yǎng)。肝星形細(xì)胞條件培養(yǎng)液(HSC-CM)收集是指將肝星形細(xì)胞鋪在細(xì)胞培養(yǎng)皿中置于37 ℃，5% CO2孵箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)80%密度后，棄舊培養(yǎng)液，加無(wú)血清無(wú)酚紅的RPMI-1640，培養(yǎng)24～48 h后，收集上清，離心5 min，1 000 r/min，0.22 μm過濾，即為肝星型細(xì)胞條件培養(yǎng)基(HSC-CM)，-20 ℃冷凍并在一星期內(nèi)使用。SMMC-7721的條件培養(yǎng)是指將細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至生長(zhǎng)期、細(xì)胞密度在70%左右時(shí)棄去舊培養(yǎng)基，加HSC-CM培養(yǎng)72 h。

1.3肝癌細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)設(shè)常規(guī)組、條件培養(yǎng)組，分別將已長(zhǎng)至80%密度的各組細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，均勻的鋪到24孔板(1×105個(gè)細(xì)胞/孔)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，次日，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用20 μL的加樣槍頭，緊貼直尺于24孔板輕輕劃一痕，用PBS洗2遍除去劃痕上的細(xì)胞，加新鮮不含血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，顯微鏡下每0、24、48、72 h各拍照1次，觀察細(xì)胞的遷移情況。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分組同遷移實(shí)驗(yàn)，小室上層Matrigel膠：DMEM培養(yǎng)基以1∶6冰上稀釋，100 μL/每孔鋪成單層，37 ℃溫箱40 min。將條件分組培養(yǎng)好的細(xì)胞消化制備細(xì)胞懸液，每孔5×105個(gè)/mL，取細(xì)胞懸液每孔400 μL加入Transwell小室孔徑8 μm，24孔板中。下室加600 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，放入孵箱培養(yǎng)24～28 h后，用棉簽在小室內(nèi)層輕輕擦試膠，用甲醇固定10 min，蘇木精染核8～10 min，伊紅染漿3～5 min，最后用70%乙醇洗滌兩遍；在20倍顯微鏡下拍照，每個(gè)小室至少拍3～5個(gè)視野，數(shù)穿越的細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.4肝癌細(xì)胞計(jì)數(shù)

常規(guī)和HSC-CM培養(yǎng)后的肝癌細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)激光共聚焦掃描顯微鏡專用的玻底皿鋪入1×105個(gè)細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)2～3 d，用4%多聚甲醛室溫固定20 min。冷PBST洗3次，5 min/次。3% BSA室溫封閉1 h，冷PBST洗3次，5 min/次，加入一抗4 ℃孵育過夜。次日用PBS洗滌3次后，給細(xì)胞上帶有熒光基團(tuán)的Dylight 549 標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)免疫熒光二抗溫育2 h和DAPI用于染色細(xì)胞核15 min。4 ℃避光保存。激光共聚焦掃描顯微鏡計(jì)數(shù)肝癌細(xì)胞。

1.5E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白及核轉(zhuǎn)錄因子Snail蛋白分析

HSC-CM采用抗原濃縮法，將肝癌細(xì)胞冰上裂解10 min，刮取裂解物，4 ℃，12 000r/min離心30 min,上樣行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜,室溫封閉1 h,加一抗稀釋液4 ℃孵育過夜。洗膜后加入二抗稀釋液室溫孵育2 h，膜上均勻加入ECL發(fā)光液，放入曝光儀內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，用圖像分析軟件對(duì)目的蛋白進(jìn)行灰度定量，計(jì)算相對(duì)灰度值。每組Western blot實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)，多樣本組間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA),P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1肝星形細(xì)胞LX2促進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC-7721遷移

與常規(guī)培養(yǎng)組相比，HSC-CM培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞SMMC-7721遷移能力增強(qiáng)，培養(yǎng)48 h和72 h時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2肝星形細(xì)胞LX2促進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC-7721侵襲

transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HSC-CM培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞SMMC-7721比常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞更具有侵襲能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3肝星形細(xì)胞LX2誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721間質(zhì)化

激光共聚焦掃描顯微鏡免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與常規(guī)培養(yǎng)組比較，HSC-CM培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào)。見圖3。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與常規(guī)培養(yǎng)組比較，HSC-CM培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin、Vimentin和核轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)水平上調(diào)。見圖4。

3討論

HSC活化是肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT的重要誘因，活化的HSC能夠分泌細(xì)胞外基質(zhì)如膠原蛋白Ⅰ、多種MMPs、各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，這些分子與肝癌細(xì)胞表面抗原或受體相結(jié)合，通過肝癌細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響肝癌細(xì)胞基因表達(dá)譜，如黏著斑和黏著帶相關(guān)蛋白，從而降低細(xì)胞與胞外基質(zhì)和細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附連接；同時(shí)，活化的肝癌細(xì)胞又分泌化學(xué)信號(hào)分子進(jìn)一步促進(jìn)HSC活化，從而進(jìn)一步改變肝癌細(xì)胞蛋白組學(xué)，最終使肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)[7]。

本研究常規(guī)培養(yǎng)HSC生長(zhǎng)至細(xì)胞密度70%～80%后，用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，使其充分活化，收集其培養(yǎng)上清液，即HSC-CM，用于肝癌細(xì)胞培養(yǎng)；條件培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞采用劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HSC-CM使肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)。另外，免疫熒光檢測(cè)條件培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞的3個(gè)EMT標(biāo)志蛋白上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)、間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào)；western blot檢測(cè)條件培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞的3個(gè)EMT標(biāo)志蛋白變化與免疫熒光檢測(cè)結(jié)果相一致；更重要的是調(diào)控EMT的核轉(zhuǎn)錄因子Snail蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)，證明肝星形細(xì)胞條件培養(yǎng)液可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT。這些結(jié)果與文獻(xiàn)所報(bào)道的結(jié)果是一致的，即從培養(yǎng)的HSC細(xì)胞上收集的條件培養(yǎng)基(CM)培養(yǎng)單層肝癌細(xì)胞，可顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖和遷移[11]。此外，肝癌內(nèi)部HSC與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，使肝癌細(xì)胞活力和生存力、遷移和侵襲能力增加并伴隨肝癌細(xì)胞獲得EMT[14]。Yang等[15]發(fā)現(xiàn)，用HSC-T6細(xì)胞的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)肝癌細(xì)胞ML1，其細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢，但是瘤形成結(jié)節(jié)數(shù)目增多，同時(shí)，體外培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞學(xué)行為也發(fā)生了一定的改變，EMT明顯。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種條件培養(yǎng)基中膠原蛋白I的含量明顯增多[10]。用RNAi的方法抑制HSC-T6細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白I的表達(dá)，條件培養(yǎng)基中膠原蛋白I也隨之減少，用這種條件培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌細(xì)胞ML1后，其EMT現(xiàn)象顯著減弱，證明HSC-T6細(xì)胞分泌的膠原蛋白I在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT過程中起著重要的調(diào)控作用[15]。另外，還有人證明活化的HSC分泌的細(xì)胞因子SDF-1/CXC在肝癌細(xì)胞EMT進(jìn)程中也起著重要的調(diào)控作用[16]?；钚訦SC分泌的SDF-1/CXC與肝癌細(xì)胞表面受體CXCR4相互作用，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)，這種現(xiàn)象能夠在單獨(dú)培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)基中添加SDF-1細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)，也能夠被CXCR4特異性拮抗劑AMD3100和RNAi技術(shù)抑制CXCR4蛋白表達(dá)所阻斷[16]。此外，Dai等[17]也發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞EMT與HSC內(nèi)miRNAs表達(dá)也密切相關(guān)。HSC活化是肝癌細(xì)胞EMT的充分條件，而miR-155表達(dá)水平直接決定HSC是否活化；在正常條件下，HSC轉(zhuǎn)錄生成的miR-155能夠與細(xì)胞內(nèi)的TCF4和AGTR1的mRNA的3’UTR相互作用，通過miRISC抑制TCF4和AGTR1蛋白表達(dá)，而肝硬化條件下的HSC以及TGFβ1處理的原代HSC和HSC-T6細(xì)胞，其蛋白表達(dá)水平顯著上升，包括TCF4、 AGTR1、ERK1、T GFβ1、a-smooth muscle actin (a-SMA)、TIMP1和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物等，這些蛋白使HSC發(fā)生活化和促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT，而這一過程能夠被miR-155模擬物所逆轉(zhuǎn)[17]。

(1)與對(duì)照組比較，P <0.05圖1　常規(guī)培養(yǎng)和條件培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞SMMC-7721的遷移能力Fig.1　Migration of SMMC-7721 cells cultured with regular medium or conditional medium

(1) 與對(duì)照組比較，P <0.05圖2　常規(guī)和條件培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞的侵襲能力(20×，孵育24～28 h)Fig.2　Invasion of SMMC-7721 cells cultured with regular medium or conditional medium for 24～28 h

注：E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 是目的蛋白,DAPI是細(xì)胞核,Merge為相應(yīng)的目的蛋白和DAPI觀察圖的疊加圖3　免疫熒光觀察E-cadherin、N-cadherin和Vimentin在SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)(10×)Fig.3　The expression of E-cadherin, N-cadherin and Vimentin in SMMC-7721 detected by immunofluorescence

圖4　Western blot實(shí)驗(yàn)觀察E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail在SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4　The expression of E-cadherin, N-cadherin,Vimentin and snail in SMMC-7721 cells detected by Western blot

以上事實(shí)證明HSC誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT的原因和機(jī)制是復(fù)雜多樣的，而上述研究得出的機(jī)制也不一定是全面的，其完整的分子機(jī)制需要繼續(xù)探索。本研究只是證實(shí)了肝星形細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)肝癌細(xì)胞的影響，并未探討活化的肝星形細(xì)胞促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的具體分子機(jī)制，相關(guān)研究有待進(jìn)一步制定、實(shí)施和論證。

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(2015-07-23收稿，2015-09-16修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

Influence of Hepatic Stellate Cell Conditional Culture Medium on HCC's Epithelial-Mesenchymal Transition

XU Guoqiang1, HUANG Xiaoqiong1, SUN Daquan2, WANG Wei1, CHEN Tengxiang1

(1.DepartmentofPhysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China; 2.DepartmentofBiochemistry&MolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of HSC conditional medium on hepatocellular carcinoma cell's (HCC) epithelial-mesenchymal transition. Methods: HCCs were cultured in HSC conditional medium, and their migration and invasion were detected by methods of cell wound healing and transwell chamber assay. Besides, laser scanning confocal microscopy (LSCM) and western blot were also adopted to detect expressions of E-cadherin (the epithelial marker), and N-cadherin and Vimentin (the mesenchymal markers) of HCCs cultivated in conditional culture medium. Snail, the nuclear transcription factor, was also detected by western blot under conditional cultivation. Results: Compared with HCCs cultivated in conventional culture medium, the ability of migration and invasion of HCC cultivated in conditional culture medium was significantly enhanced (P<0.05), the expression of E-cadherin downregulated, the expression of N-cadherin and Vimentin upregulated in and the expression of snail upregulated (P<0.05). Conclusion: Conditional medium of HSC conditional medium can promote HCC epithelial-mesenchymal transition.

[Key words]carcinoma，hepatocellular; astrocytes; epithelial-mesenchymal transition; cell culture; culture media,conditioned

[中圖分類號(hào)]R735.7.023

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)01-0032-05

*[基金項(xiàng)目]貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目[黔科合LG字(2012)007]；貴州省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目[黔教科(2008)022號(hào)]

**通信作者 E-mail:gqxu@gmc.edu.cn網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160107.1953.020.html