趙孝梅， 何　燕， 張旺德， 張　婷， 王嬋娟， 吳昌學， 官志忠

(貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽　550004)

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貴州省布依族和苗族HLA-C基因rs3130542位點多態(tài)性研究*

趙孝梅， 何燕**， 張旺德， 張婷， 王嬋娟， 吳昌學， 官志忠

(貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究HLA -C 基因rs3130542位點在貴州省布依族和苗族人群中的分布特征，探討該位點在不同群體間的分布差異。方法： 應用TaqMan-MGB探針基因分型方法，檢測貴州布依族(289例)和苗族(174例)群體HLA -C 基因rs3130542 SNP多態(tài)位點的基因頻率及基因型頻率，比較同一性別不同民族及同一民族不同性別人群間HLA -C 基因rs3130542 SNP多態(tài)位點的基因頻率及基因型頻率，并與人類基因組計劃網(wǎng)站公布的中國北京人群、日本人群、歐洲人群及非洲人群的分布特點進行比對。結(jié)果： 布依族和苗族群體比較HLA-C 基因rs3130542位點等位基因頻率和基因型頻率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同一民族群體不同性別之間比較HLA-C 基因rs3130542位點多態(tài)性分布差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與人類基因組計劃網(wǎng)站公布的其他人群相比，貴州苗族布依族人群HLA-C 基因rs3130542位點的基因型頻率與中國北京人群間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，等位基因和基因型頻率與日本人群間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但與歐洲人群間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，等位基因頻率與非洲人群間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論： HLA-C 基因rs3130542位點在不同地域、不同民族或種族之間分布存在一定的差異；但在貴州省苗族和布依族同一民族男女性別中的分布差異無統(tǒng)計學意義。

[關(guān)鍵詞]HLA-C抗原； 基因多態(tài)性； 等位基因； 基因型； 少數(shù)民族

HLA-C是人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)的一個基因座，屬于經(jīng)典的HLA-Ι類分子。HLA-C所含的等位基因相對較少但存在著高度的多態(tài)性[1]。近年來有關(guān)HLA-C基因多態(tài)性與疾病進展的研究不斷地增加和深入，發(fā)現(xiàn)HLA-C基因多態(tài)性與許多疾病如HBV感染[2]、HIV感染[3]、神經(jīng)纖維瘤病Ι型[4]、早期復發(fā)性流產(chǎn)[5]、梅毒[6]、人類T淋巴細胞白血病病毒I型(HTLV-1)[7]等均存在一定的相關(guān)性。由于特定的生活習俗和特殊的地理分布使得某些疾病在少數(shù)民族人群中發(fā)病率較高，因此本研究選取貴州省人口較多的2個少數(shù)民族(布依族和苗族)為研究對象，分析其群體中HLA-C 基因rs3130542位點的分布特征，為進一步研究HLA-C 基因與某些疾病的相關(guān)性及關(guān)聯(lián)機制提供一定的參考，同時也為群體遺傳學的研究提供一定的基礎參考數(shù)據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1對象與方法

1.1對象

根據(jù)知情同意原則，隨機采集貴州省世居布依族和苗族無關(guān)個體外周血2 mL，所選的研究對象三代內(nèi)均無族外通婚，彼此間無直接的血緣關(guān)系，無遺傳病史。兩個民族共463例。其中，布依族289例, 男134例，(50.17±9.19)歲，女155例，(48.12±3.54)歲；苗族174例，男70例，(49.99±19.80)歲，女104例，(49.14±19.80)歲。兩個民族研究對象的年齡和性別比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1DNA提取采用德國QIAGEN公司的FlexiGenen DNA Kit 全血基因組DNA提取試劑盒提取外周血DNA，并進行DNA濃度和純度檢測(DU 640蛋白質(zhì)核酸定量分析儀，美國Beckman公司)，DNA終濃度標化至30 g/L，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2基因分型采用美國ABI公司的StepOne plus 實時熒光定量PCR儀和TaqMan SNP Genotyping Assays對HLA-C基因rs3130542位點進行基因分型。PCR反應為10 μL體系：DNA溶液(30 g/L)1.5 μL，×Taqman Universal Master Mix 5.0 μL，20×Assay Working Stock 0.25 μL加ddH2O補足10 μL。PCR反應條件為：60 ℃ 30 s，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min， 共55個循環(huán)，60 ℃ 30 s。用Step One Software v2.1軟件根據(jù)熒光發(fā)光的特點分析基因分型的結(jié)果。

1.2.3測序驗證根據(jù)基因分型結(jié)果，每種基因型隨機抽取5個樣本送Life公司測序驗證。測序引物如下：上游5′-GACTTCCCGCAACAACAG-3′，下游5′-CAT CTTTCCACCCATTCC-3′。

1.3觀察指標

對采集的血液標本進行基因型和等位基因頻率Hardy-Weinberg 平衡檢驗，觀察布依族和苗族人群rs3130542位點基因型和等位基因頻率，比較兩個群體間不同性別個體、群體內(nèi)部不同性別個體的rs3130542位點基因型和等位基因頻率，并將貴州地區(qū)苗族布依族人群中HLA-C 基因rs3130542位點的多態(tài)性分布頻率與人類基因組計劃網(wǎng)站(http://www.hapmap.org)公布的不同地區(qū)人群的掃描結(jié)果進行比較。

1.4統(tǒng)計學分析

卡方檢驗分析rs3130542位點基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用SPSS19.0軟件對結(jié)果進行分析，基因型和等位基因型頻率用直接計數(shù)法計算，組間分布差異用卡方檢驗進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg 平衡檢驗

本研究群體基因型和等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)，提示本研究所選取的樣本具有較好的群體代表性。

2.2HLA-C基因rs3130542 SNP位點基因分型

注：A為HLA-C A/G 位點PCR擴增圖；B 為SNP分型圖，圖中紅點代表野生型HLA-C AA純合子，藍點代表純合突變型HLA-C GG，綠點代表雜合型HLA-C AG，黑色方塊代表空白對照(NTC)圖1　人基因組rs3130542(HLA-C)SNP位點的TaqMan探針實時熒光定量PCR結(jié)果Fig.1　The genotyping results of rs3130542 (HLA-C) SNP loci by using TaqMan probe real-time quantitative PCR

2.2.1HLA-C基因分型人基因組rs3130542(HLA-C)SNP位點的TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR擴增曲線如圖1A。根據(jù)人基因組rs3130542(HLA-C)TaqMan探針分型試劑盒(TaqMan? SNP Genotyping Assays)信息，并采用StepOne Software v2.1軟件分析PCR 擴增后收集的熒光，等位基因分布圖中X軸代表VIC探針(HLA-C AA)，Y軸代表FAM 探針(HLA-C GG)，樣品集中分布在4個區(qū)域：3個空白對照組在接近原點的對角線上，靠近X軸的紅點代表該樣本為HLA-C AA野生型；靠近Y軸的藍色點則代表該樣本為HLA-C GG純合突變型；處于對角線上的綠色點則為HLA-C AG雜合型(圖1B)。2.2.2測序驗證結(jié)果從HLA-C A/G(rs3130542)基因分型結(jié)果中隨機選取5%的樣本進行測序驗證，測序結(jié)果顯示與TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR對基因分型的結(jié)果完全符合。測序結(jié)果見圖2。

2.3同一性別不同民族群體HLA-C A/G(rs3130542)基因分型和等位基因頻率分布

布依族與苗族群體比較HLA-C A/G(rs3130542)基因型(χ2=7.987，P=0.018)及等位基因頻率(χ2=8.742，P=0.003)差異有統(tǒng)計學意義，見表1。男性群體中，布依族、苗族人群比較HLA-C A/G(rs3130542)基因型及等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；女性群體中，布依族和苗族人群比較HLA-C A/G(rs3130542)等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.876，P=0.027)，基因型分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.4同一民族不同性別人群中HLA-C A/G(rs3130542)基因型及等位基因頻率分布

貴州省布依族和苗族同一群體不同性別之間比較，HLA-C A/G(rs3130542)基因型分布和等位基因頻率均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

注： A、B、C分別代表測序結(jié)果為AA純合子、GG純合子和AG雜合子(箭頭所指處)圖2　HLA-C基因rs3130542(A/G)位點測序結(jié)果Fig.2　The sequencing results of HLA-C gene rs3130542 (A / G) locus

2.5貴州地區(qū)苗族布依族人群與其它地區(qū)人群HLA-C 基因rs3130542位點多態(tài)性的比較

將貴州地區(qū)苗族布依族人群中HLA-C 基因rs3130542位點的多態(tài)性分布頻率與人類基因組計劃網(wǎng)站(http://www.hapmap.org)公布的其它地區(qū)人群的掃描結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示，貴州地區(qū)苗族布依族人群HLA-C 基因rs3130542位點與與中國北京人群比較基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與日本人群(JPT)比較基因型和等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與歐洲人群(CEU)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與非洲人群(YRI)比較等位基因頻率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表4。

表1　貴州省布依族和苗族群體HLA-C基因rs3130542位點基因型及等位基因頻率分布(n,%)

表2　同一性別布依族和苗族群體HLA-C基因rs3130542位點

表3　貴州省布依族和苗族同一群體不同性別個體HLA-C基因rs3130542位點

表4　不同地區(qū)人群HLA-C A/G(rs3130542)基因型及等位基因頻率比較(n,%)

3討論

HLA-C可作為殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglo-bulin-like receptor, KIR)的配體，并與之相結(jié)合影響NK細胞的活性[8-9]，進而在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。而國際人類基因組單體型圖計劃(Hap map project)指出人類基因組中約有300多萬個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點[10]。SNP具有多態(tài)信息含量大、密度高、遺傳穩(wěn)定和易于檢測等優(yōu)點，因而非常適宜用于常見疾病的易感基因研究。

本研究的受檢人群中，布依族和苗族比較HLA-C A/G(rs3130542)等位基因頻率和基因型差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，因此可推測HLA-C基因rs3130542 SNP位點多態(tài)性分布存在民族差異性。雖然布依族和苗族同為漢藏語系，但二者分屬不同的語族群體(分別為壯侗語族、苗瑤語族)，隨著歷史的不斷演變與人類的進化已使它們各自的遺傳背景發(fā)生了一定的改變，進一步導致遺傳多樣性和特異性的存在。同一性別不同民族群體之間比較結(jié)果顯示，女性群體中布依族和苗族人群比較HLA-C基因rs3130542 SNP位點等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而同一民族群體不同性別之間比較HLA-C基因rs3130542 SNP位點多態(tài)性分布差異均無統(tǒng)計學意義；提示HLA-C基因rs3130542 SNP位點多態(tài)性分布的性別差異性不明顯。

貴州地區(qū)苗族布依族人群與人類基因組計劃網(wǎng)站公布的不同地區(qū)及種族的HLA-C基因rs3130542 SNP位點多態(tài)性進行比較可知：貴州苗族布依族人群和北京人群雖然種族相同、地理位置相對較近，但二者HLA-C 基因rs3130542位點等位基因頻率的分布還是存在一定的差異性，提示可能為民族差異所致；從地域角度講，貴州苗族布依族人群和日本人群在遺傳學分類上同屬東亞人群，但由于中國和日本之間存在地理隔離，影響了基因的交匯，從而造成了地區(qū)間基因的差異[11]；貴州苗族布依族人群與非洲人群比較等位基因頻率差異明顯，說明HLA-C 基因rs3130542位點存在種族和地域的差異性；而貴州苗族布依族人群與歐洲人群雖存在種族和地域的差異，但二者HLA-C 基因rs3130542位點的分布卻很相似，其原因還需綜合所有可能相關(guān)的因素進一步分析探究。

中國是一個多民族的國家，而貴州又是一個擁有17種世居少數(shù)民族的多民族聚居的省份，其中苗族、布依族為全省人口數(shù)最多的兩個民族，了解貴州苗族、布依族的HLA-C基因多態(tài)性的分布情況可為接下來進一步研究HLA-C基因多態(tài)性與一些疾病的發(fā)生與進展的關(guān)聯(lián)提供一定的理論依據(jù)，從而有助于深入了解某些疾病在不同種族及地區(qū)之間的遺傳背景的差異，以達到了解、預防和治療疾病的目的。

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(2015-10-15收稿，2015-12-05修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

A Study ofHLA-C gene rs3130542 SNP Polymorphism in Buyi and Miao Ethnics Groups in Guizhou

ZHAO Xiaomei, HE Yan, ZHANG Wangde, ZHANG Ting, WANG Chanjuan, WU Changxue, GUAN Zhizhong

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate distribution characteristics of rs3130542 site of HLA-C gene Buyi and Miao ethnics and explore its distribution differences in different minorities. Method: TaqMan-MGB based on real-time PCR was used to determine the gene frequencies and genotype frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP polymorphism in Buyi ethnics(289 cases) and Miao ethnics(174 cases) of Guizhou. The gene frequencies and genotype frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP polymorphism were compared between the same sex people in different nationalities, between the same nationalities in different sexes and between Guizhou population and other populations of different regions and ethnic groups whose gene information was published by Human Genome Project. Results: There were significant differences of allele gene frequencies and genotype frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP polymorphism between Buyi nationality and Miao nationality (P<0.05). No statistically significant difference was found between male and female in the same ethnic group about HLA-C gene rs3130542 polymorphism distribution (P>0.05). There were statistically significant differences of genotype frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP polymorphism between the Buyi, Miao ethnic groups in Guizhou and the Beijing Chinese people (P<0.05). There were significant differences of allele frequencies and genotype frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP polymorphism between Buyi, Miao nationality and Japanese population (P<0.05) and there were significant differences of allele gene frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP polymorphism between Buyi, Miao nationality and African population (P<0.05). However, no significant difference was found in allele frequencies and genotype frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP between the Buyi , Miao ethnic groups and European population. Conclusion: The allele and genotypes frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP locus show significant differences among different ethnic groups, regional groups and racial groups. No significant difference is found between the male and female of the Buyi and Miao ethnic groups in Guizhou about HLA-C gene rs3130542 polymorphism distribution.

[Key words]HLA-C antigens; gene polymorphism; alleles; genotype; minority groups

[中圖分類號]R342

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)01-0012-05

*[基金項目]國家科技支撐計劃項目(2013BAI05B03)； 貴州省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”[黔教合協(xié)同創(chuàng)新中心(2014)06號]

**通信作者 E-mail:annieheyan@gmc.edu.cn網(wǎng)絡出版時間：2016-01-07

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160107.2118.062.html