郭雅潔,　李　蘋(píng),　伍忠玲,　鄭茹萍,　張　俊,　胡　霞*

1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院, 福州 350002;

2.福建農(nóng)林大學(xué), 生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002

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Cry毒素殺蟲(chóng)活性分子改造方法研究進(jìn)展

郭雅潔1,2,李蘋(píng)1,伍忠玲1,鄭茹萍1,張俊1,2,胡霞1*

1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院, 福州 350002;

2.福建農(nóng)林大學(xué), 生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002

摘要：蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)產(chǎn)生的Cry毒素為防治害蟲(chóng)提供了一種寶貴的資源。但昆蟲(chóng)中腸蛋白酶的活化作用在不同的昆蟲(chóng)中對(duì)Cry毒素的殺蟲(chóng)活性有限制性。分析了幾種不同的策略來(lái)增加Cry毒素對(duì)靶標(biāo)昆蟲(chóng)的毒性，包括結(jié)構(gòu)域Ⅲ交換、結(jié)構(gòu)域Ⅱ和結(jié)構(gòu)域Ⅲ的突變以及其他突變。此外，還詳細(xì)闡述了噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行毒素優(yōu)化的方法，毒素優(yōu)化能夠增加Cry毒素對(duì)親本Cry毒素敏感度較低的害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性，以期為Cry毒素的分子改造和應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽胞桿菌；Cry毒素；進(jìn)化；分子改造

蘇云金芽胞桿菌(Bt)是一類分布極為廣泛的革蘭氏陽(yáng)性菌，其殺蟲(chóng)活性主要來(lái)自芽孢形成期在菌體一端或兩端形成的伴孢晶體，即殺蟲(chóng)晶體蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)，可分為Cry和Cyt兩類。Bravo等[1]證實(shí)Bt能夠有效防治主要的農(nóng)作物害蟲(chóng)和攜帶登革熱和瘧疾病菌等人類疾病的蚊子。然而，蘇云金芽孢桿菌作為生物殺蟲(chóng)劑使用是伴隨著B(niǎo)t轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展開(kāi)始的，其在農(nóng)作物中表達(dá)的cry基因能夠抵抗鉆蛀性害蟲(chóng)在內(nèi)的昆蟲(chóng)的攻擊[2]。Bt內(nèi)具有殺蟲(chóng)活性的晶體內(nèi)含物是伴隨著芽孢的形成而產(chǎn)生的，它們是由多種殺蟲(chóng)蛋白即Cry或Cyt毒素組成的。但這些毒素表現(xiàn)出較高的特異性，只能殺死小范圍的昆蟲(chóng)物種。

已有數(shù)據(jù)表明Bt對(duì)鱗翅目、膜翅目和同翅目等16個(gè)目3 000多種害蟲(chóng)有殺蟲(chóng)活性[3]。然而，到目前為止仍然有許多害蟲(chóng)對(duì)于cry基因不敏感或不能被Cry蛋白有效控制。而在對(duì)轉(zhuǎn)基因植物使用Cry毒素的過(guò)程中存在的主要問(wèn)題是昆蟲(chóng)抗藥性的出現(xiàn)，因此，在自然界中對(duì)于Cry毒素進(jìn)行體外改造，以增強(qiáng)其對(duì)特定害蟲(chóng)的毒性，殺死新的靶標(biāo)昆蟲(chóng)從而防止野外抗性的出現(xiàn)具有非常重要的意義。

1Cry毒素殺蟲(chóng)活性的體外進(jìn)化

1.1Cry毒素的水解活性

在不同的昆蟲(chóng)物種中，昆蟲(chóng)中腸蛋白酶的活化作用是影響Cry毒素活性的關(guān)鍵步驟。Cry3Aa對(duì)于鞘翅目昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)如馬鈴薯甲蟲(chóng)(Leptinotarsadecemlineata)有很強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性，而對(duì)玉米根螢葉甲(Diabroticavirgiferavirgifera)的毒性卻很低，這是由于蛋白酶對(duì)Cry3Aa溶解度較低,而使其產(chǎn)生67 kDa的片段。然而，有研究證明通過(guò)糜蛋白酶處理能夠增加完整的55 kDa Cry3A片段的產(chǎn)量，這表明在整個(gè)過(guò)程中Cry毒素的溶解性和毒性得到了增加[4]。經(jīng)證明55 kDa的片段是結(jié)構(gòu)域Ⅰ的α3-α4循環(huán)區(qū)域切割的片段[4]。在 Cry3Aa α3-α4的螺旋位置(命名為mCry3Aa)引進(jìn)一個(gè)糜蛋白酶或組織蛋白G蛋白進(jìn)行水解使55 kDa片段的產(chǎn)量增加，隨之其對(duì)玉米根螢葉甲的毒性也得到了增加。mCry3Aa毒素的增加與55 kDa片段溶解度的增加有關(guān)，也與55 kDa片段和玉米根螢葉甲刷狀緣膜囊泡(BBMV)的特異性結(jié)合有關(guān)[5]。同時(shí)，mCry3Aa對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)的幼蟲(chóng)表現(xiàn)出了類似于Cry3Aa的殺蟲(chóng)活性，這表明位于mCry3Aa中的工程蛋白酶擴(kuò)大了殺蟲(chóng)活性甚至改變了其昆蟲(chóng)特異性。在轉(zhuǎn)基因玉米中mCry3Aa已經(jīng)得到了較好的應(yīng)用，能有效的防治玉米根螢葉甲[6]。

昆蟲(chóng)抗藥性的出現(xiàn)制約了Cry毒素在轉(zhuǎn)基因植物中的使用[7]。已有研究表明，不同的鱗翅類昆蟲(chóng)群落對(duì)Cry1Ab或Cry1Ac毒素的抗性與鈣粘蛋白基因的突變有關(guān)[8]。與鈣粘蛋白的結(jié)合對(duì)Cry1A毒素的活性是一個(gè)限制步驟，因?yàn)樗谴龠M(jìn)螺旋α1進(jìn)一步水解移除并使毒素寡聚化所必需的。經(jīng)證明，缺乏鈣粘蛋白的蛋白酶激活的Cry1Ab和Cry1Ac毒素轉(zhuǎn)基因植物刪除螺旋α1 (Cry1AbMod 或 Cry1AcMod)在體外形成寡聚物，相比而言，自然毒素在鈣粘蛋白結(jié)合位點(diǎn)存在時(shí)只形成低聚物的結(jié)構(gòu)。對(duì)Cry1AbMod 和 Cry1AcMod有抗性的棉紅鈴蟲(chóng)(Pectinophoragossypiella)Cry1Ac耐藥品系與鈣粘蛋白基因的突變有關(guān)[9]。這個(gè)結(jié)果表明Cry1AMod毒素有可能對(duì)抗昆蟲(chóng)抗藥性，突變抗藥性影響鈣粘蛋白的表達(dá)。后續(xù)研究分析表明，Cry1AbMod和Cry1AcMod對(duì)7種不同的鱗翅類昆蟲(chóng)抗藥品系的抵抗作用在某些情況下不會(huì)因突變影響鈣粘蛋白的表達(dá)。Cry1Ac耐藥品系的抗藥性最近已被證明，Cry1Ac是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCC2)基因突變的等位基因。ABCC2的突變影響著Cry1Ab 和Cry1Ac與刷狀緣膜囊的結(jié)合能力，表明ABCC2 蛋白可以促進(jìn)低聚物插入細(xì)胞膜[10]。同時(shí)，Cry1AMod毒素的分析包括兩個(gè)領(lǐng)域，即小菜蛾(Plutellaxylostella)和粉紋夜蛾(Trichoplusiani)的Cry1Ac耐藥品系的進(jìn)化，其與ABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因突變有關(guān)[11]。數(shù)據(jù)顯示，在這兩種昆蟲(chóng)中，Cry1AMod有抗性，并且在煙草夜蛾幼蟲(chóng)包含ABCC2和鈣粘蛋白突變等位基因的耐藥品系中也有抗性。然而，Cry1AbMod和Cry1AcMod對(duì)煙草夜蛾幼蟲(chóng)中鈣粘蛋白或ABCC2單突變體的昆蟲(chóng)群落并不是非常有效[12]。需重點(diǎn)說(shuō)明的是，Cry1AbMod和Cry1Ac毒素對(duì)煙草夜蛾幼蟲(chóng)的易感抗性不是非常有效，并且也有明顯的削減現(xiàn)象。這表明，低效的Cry1AbMod毒素對(duì)易感昆蟲(chóng)的抗性較低，如煙草夜蛾幼蟲(chóng)群落只有其鈣粘蛋白基因或ABCC2基因受到Cry1AbMod毒素的影響，這可能是由于和親本Cry1A 毒素相比，Cry1AbMod毒素活性降低所致。這些結(jié)果表明Cry1A毒素的作用方式要復(fù)雜的多，包括額外的蛋白質(zhì)如ABCC2轉(zhuǎn)運(yùn)體，盡管Cry1AMod毒素在抵抗一些害蟲(chóng)時(shí)可能功效較低，他們可能基于不同的作用機(jī)制來(lái)產(chǎn)生抗藥性[12]，其原因還有待分析，這可為Cry1AMod毒素的進(jìn)一步改造提供思路。

1.2結(jié)構(gòu)域Ⅲ交換

經(jīng)分析表明，結(jié)構(gòu)域Ⅲ被認(rèn)為是一種參與Cry毒素進(jìn)化的自然機(jī)制。在某些情況下，體外的不同Cry毒素的結(jié)構(gòu)域Ⅲ交換產(chǎn)生毒性提高的混合毒素來(lái)對(duì)抗特定的昆蟲(chóng)[13]。de Maagd等[14]構(gòu)建了一個(gè)混合毒素，包括來(lái)自 Cry1Ab毒素的結(jié)構(gòu)域Ⅰ和結(jié)構(gòu)域Ⅱ以及Cry1C的結(jié)構(gòu)域Ⅲ，與Cry1C相比對(duì)甜菜夜蛾(Spodopteraexigua) 顯示出高6倍以上的毒性。岳琳等[15]將Cry1Ab的結(jié)構(gòu)域Ⅰ和結(jié)構(gòu)域Ⅱ以及Cry1Ac的結(jié)構(gòu)域Ⅲ結(jié)合構(gòu)建了新型的cryNAc抗蟲(chóng)基因，該轉(zhuǎn)基因水稻也得到了較好的抗二化螟效果。根據(jù)結(jié)構(gòu)域Ⅲ交換而改造的毒素對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)如馬鈴薯甲蟲(chóng)的活性得到了提高，相比較而言，Cry1Ba 和 Cry1Ia對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)顯示出低毒性。 Naimov等[16]用Cry1Ia的結(jié)構(gòu)域Ⅰ和結(jié)構(gòu)域Ⅱ以及Cry1Ba的結(jié)構(gòu)域Ⅲ構(gòu)建了混合毒素，對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性比Cy1Ia和Cry1Ba親本毒素分別高出3~7倍。根據(jù)結(jié)構(gòu)域Ⅲ交換的原理改造毒素的另一個(gè)例子，即利用Cry3Aa的結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ以及Cry1Ab(eCry3.1Ab)的結(jié)構(gòu)域Ⅲ構(gòu)建混合毒素。相較于Cry3Aa和Cry1Abe對(duì)玉米根螢葉甲沒(méi)有毒性，Cry3.1Ab對(duì)其是有毒性的[17]。特別的是Cry1Ab對(duì)鱗翅類昆蟲(chóng)是一種特異性毒素，它的結(jié)構(gòu)域Ⅲ能夠提高作用于鞘翅目害蟲(chóng)的特定毒素如Cry3Aa的毒性。已有研究證明轉(zhuǎn)cry3.1Ab基因玉米在防治玉米根螢葉甲方面是有效的[9]。以上研究結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)域Ⅲ交換對(duì)于改善Cry毒素的毒性或利用對(duì)害蟲(chóng)不敏感的親本Cry毒素構(gòu)建新的混合毒素是應(yīng)用中有效的方法。對(duì)cry基因的3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行大量的交換[18]，并通過(guò)高生物鑒定篩選方法可能為Cry毒素的改善或構(gòu)建新的毒素提供了新的思路。

1.3結(jié)構(gòu)域Ⅱ和結(jié)構(gòu)域Ⅲ突變

經(jīng)證明，結(jié)構(gòu)域Ⅱ中裸露的螺旋區(qū)域是決定昆蟲(chóng)特異性的重要因素[19]。Cry4Ba對(duì)庫(kù)蚊沒(méi)有毒性，而 Cry4Aa對(duì)其有很強(qiáng)的活性[20]。將Cry4Aa結(jié)構(gòu)域Ⅱ循環(huán)3氨基酸序列引入Cry4Bb結(jié)構(gòu)域Ⅱ循環(huán)3序列中，該突變體毒素(4BL3GAV)對(duì)庫(kù)蚊產(chǎn)生了毒性，同時(shí)對(duì)埃及伊蚊的殺蟲(chóng)活性也得到了保留[20]。同樣的思路，對(duì)鱗翅類Cry1Aa毒素模仿Cry4Bb突變體4BLGAV結(jié)構(gòu)域Ⅱ的螺旋區(qū)域進(jìn)行了設(shè)計(jì)，使得Cry1Aa(1AaMosq)對(duì)尖音庫(kù)蚊幼蟲(chóng)產(chǎn)生活性，不過(guò)活性比4BLGAV低了3倍[21]。以上結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)域Ⅱ循環(huán)區(qū)域的交換為提高或改善Cry毒素的特異性提供了一種方法。在某些情況下，結(jié)構(gòu)域Ⅱ循環(huán)區(qū)域序列的定點(diǎn)誘變使得突變體毒素的殺蟲(chóng)活性增加，第一個(gè)例子是循環(huán)2結(jié)構(gòu)發(fā)生突變的Cry1Ab毒素對(duì)舞毒蛾 (Limantriadispar)產(chǎn)生了較高的殺毒活性[22]。單個(gè)Cry1Ab循環(huán)2的突變體N372A或殘留物中一個(gè)三重循環(huán)2的突變體A282G和L283S能夠?qū)ξ瓒径暧紫x(chóng)分別顯示出8~36倍的毒性。同時(shí)，殺蟲(chóng)活性的提高與舞毒蛾中分離出來(lái)的BBMV結(jié)合親和力的增加有關(guān)[23]。同樣，這也表明Cry3Aa的結(jié)構(gòu)域Ⅱ環(huán)區(qū)的突變體對(duì)鞘翅目昆蟲(chóng)黃粉甲(Tenebriomolitor)的毒性得到了提高[24]。結(jié)構(gòu)域Ⅱ循環(huán)Ⅰ區(qū)域的三重突變 R345、Y350F、Y351F顯示出比 Cry3Aa對(duì)黃粉甲高10倍的毒性和對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)高2倍的毒性，這也與馬鈴薯甲蟲(chóng)的BBMV高出2倍的結(jié)合能力有關(guān)[23]。這些結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)域Ⅱ循環(huán)區(qū)域是Cry毒素的重要結(jié)合區(qū)域，為提高毒素的殺蟲(chóng)活性，該區(qū)域是進(jìn)行突變的合適目標(biāo)。對(duì)于2個(gè)不同結(jié)構(gòu)域Ⅲ的裸露循環(huán)區(qū)域的突變，只有幾個(gè)例子顯現(xiàn)出其對(duì)不同昆蟲(chóng)種類有溫和的毒性，但毒性的增加并不顯著[24~27]。然而，已有研究對(duì)錨定的結(jié)構(gòu)域Ⅲ抗原與ALP或APN受體的結(jié)合研究很少[28~30]。這些結(jié)構(gòu)域Ⅲ的結(jié)合區(qū)域的誘變可能為Cry毒素殺蟲(chóng)活性的增加提供了理論基礎(chǔ)，比如結(jié)構(gòu)域Ⅲ交換已經(jīng)被運(yùn)用于構(gòu)建新的毒素從而提高毒性[14]。

1.4Cry毒素的其他突變

結(jié)構(gòu)域Ⅰ突變除了所熟悉的引入蛋白酶分裂位置之外，對(duì)Cry1Ab或Cry2Aa的結(jié)構(gòu)域Ⅰ的改造也可以使殺蟲(chóng)活性得到提高。Cry1Ac螺旋α5突變體V171C對(duì)舞毒蛾顯示出高達(dá)25倍的殺蟲(chóng)活性而不影響其對(duì)煙草天蛾幼蟲(chóng)的毒性[30]。Cry1Ac V171C毒性的增加是由于高效的解鏈速率使得毒素更快的解鏈而插入膜中[31]。對(duì)Cry2Aa而言，結(jié)構(gòu)域Ⅰ的兩個(gè)改造使得Cry2Aa突變體對(duì)斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)和球菜夜蛾(Agrotisipsilon)顯示出高達(dá)4~6倍的毒性。Cry2Aa的第一個(gè)改造包括切除N末端的第一個(gè)42氨基酸殘基，Cry2Ab結(jié)構(gòu)域Ⅰ螺旋α1前顯示第一個(gè)49氨基酸，這些殘基通常在Cry2Ab蛋白質(zhì)的蛋白酶激活期間被切除。N末端裸露出參與受體相互作用的封閉結(jié)構(gòu)域Ⅱ的疏水性碎片[32]。因此，N端蛋白質(zhì)片段的蛋白水解分裂作用可能是避免42氨基酸被切除的一個(gè)限速步驟[33]。Cry2Aa螺旋α1的殘留物兩個(gè)額外的突變K63F和K64P是基于提高四氯化硅跨膜運(yùn)輸區(qū)域的疏水性原理而提出的[33]。最后，Cry3Aa通過(guò)融合一個(gè)8氨基酸殘基被證明是特異天牛腸羧甲基纖維素酶使得其對(duì)光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)有高達(dá)3倍的殺蟲(chóng)活性[34]。因此也有研究提出融合肽通過(guò)結(jié)合腸道纖維素酶來(lái)增加腸道的毒素[34]。

2Cry毒素進(jìn)化的高通量輸出技術(shù)——噬菌體展示技術(shù)

如上所述，在Cry結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ中通過(guò)定點(diǎn)誘變結(jié)合抗原從而提高殺蟲(chóng)活性，這對(duì)于提高Cry毒素對(duì)不同昆蟲(chóng)的活性具有很大的潛力，如不同的Cry毒素改造的例子所示，改造相應(yīng)的氨基酸區(qū)域可以提高毒素的殺蟲(chóng)活性。然而，這些例子的分析結(jié)果是從不同種類的昆蟲(chóng)中的幾個(gè)突變體得到的，而不是高通量輸出系統(tǒng)。

據(jù)報(bào)道，基因轉(zhuǎn)移對(duì)于cry基因突變體庫(kù)的構(gòu)建是一個(gè)有效的方法，能夠增加殺蟲(chóng)活性。Lassner等[35]通過(guò)Cry1Ca蛋白質(zhì)演化增加對(duì)粘蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性。通過(guò)生物檢測(cè)篩選出改造的 Cry1Ca突變體，這些突變體對(duì)煙草蚜蟲(chóng)顯示出比親本Cry1Ca毒素高出5倍的毒性。然而使得Cry1Ca 蛋白質(zhì)殺蟲(chóng)活性增強(qiáng)的區(qū)域還沒(méi)有明確。在許多變體中選出所需的突變體，這種方法可能會(huì)提供更好的Cry突變體毒素。然而，從許多Cry毒素變體中進(jìn)行篩選時(shí)，通過(guò)生物檢測(cè)來(lái)識(shí)別改造突變體是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。因此，理想的方法應(yīng)該是從Cry突變體庫(kù)中篩選能結(jié)合來(lái)自靶標(biāo)昆蟲(chóng)中的BBMV或純化來(lái)自靶標(biāo)昆蟲(chóng)的受體分子。在最后一種情況下，它需要限制Cry毒素結(jié)合區(qū)域的誘變，這對(duì)于與特定受體分子的結(jié)合是很重要的。

2.1噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)能夠快速選擇突變體，從而提高結(jié)合的特異性[35,36]。此外，外源蛋白DNA序列融合外殼蛋白基因使得融合蛋白在噬菌體的表面展示出來(lái)，并可以通過(guò)噬菌體與配體相互作用被篩選出來(lái)，這一過(guò)程叫做生物淘選。通過(guò)將目標(biāo)蛋白質(zhì)與衣殼蛋白質(zhì)比如衣殼蛋白質(zhì)p3 或 p8融合而構(gòu)建絲狀M13噬菌體庫(kù)。融合蛋白可能被合并為噬菌體基因體或成為分子載體即噬菌體。噬菌體載體包含一個(gè)外殼蛋白基因，通常有一個(gè)確定的位置進(jìn)行蛋白質(zhì)融合，一個(gè)氨芐青霉素抗生素作為抗性基因以及利用質(zhì)粒復(fù)制位點(diǎn)在大腸桿菌細(xì)胞中復(fù)制的能力[36,37]。展示融合蛋白必須通過(guò)一個(gè)前導(dǎo)肽序列改變主機(jī)周質(zhì)的位置，而輔助噬菌體為噬菌體組裝提供了必要的組件。這是一個(gè)功能強(qiáng)大的技術(shù)，所選的噬菌體在顯示蛋白和編碼基因之間通過(guò)生物淘選的物理鏈路進(jìn)一步誘變并選擇，該鏈路允許體外高通過(guò)輸出蛋白質(zhì)分子進(jìn)行演化[38]。

2.2噬菌體最優(yōu)系統(tǒng)的選擇

Cry1A毒素已經(jīng)在M13和T7等噬菌體中成功表達(dá)，然而，對(duì)于展示Cry1A毒素來(lái)說(shuō)這些系統(tǒng)并不是最優(yōu)系統(tǒng)[39~42]。M13噬菌體展示系統(tǒng)在展示時(shí)的一個(gè)固有問(wèn)題是大分子蛋白質(zhì)作為融合蛋白必須運(yùn)送到大腸桿菌發(fā)生噬菌體組裝的周質(zhì)中。Cry1Aa第一次被展示出來(lái)是在M13中[39,40]，這顯示出在融合毒素蛋白時(shí)會(huì)發(fā)生重要的刪減[39]。然而，另一份報(bào)告中，Cry1Ac在M13中的展示顯示出對(duì)煙草蚜蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒性，但同時(shí)也顯示出Cry1Ac蛋白在體外沒(méi)有結(jié)合APN受體的功能，展示的毒素結(jié)構(gòu)受到約束[40]。之后的結(jié)果表明，噬菌體l和T7這兩個(gè)系統(tǒng)可能是更優(yōu)的系統(tǒng)，用來(lái)顯示細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中Cry1A毒素作為噬菌體粒子允許大蛋白質(zhì)的展示[41,42]。對(duì)于噬菌體l，Cry1Ac蛋白質(zhì)與衣殼蛋白D融合并且在噬菌體粒子表面得到展示。Cry1Ac毒素的展示保留了與野生型毒素相似的對(duì)煙草天蛾幼蟲(chóng)的毒性以及與APN受體相互作用的能力[41]。另一個(gè)報(bào)告顯示，Cry1Ac基因能夠與T7 10B衣殼蛋白基因的3′端融合，并且嵌合蛋白在T7 噬菌體的表面進(jìn)行展示。T7-Cry1Ac結(jié)合Cry1Ac受體和BBMV來(lái)分離煙草天蛾幼蟲(chóng)并保留對(duì)煙草天蛾幼蟲(chóng)的毒性，這些結(jié)果表明Cry1Ac毒素在T7噬菌體中可以得到成功展示[42]。然而，l和T7系統(tǒng)展示的一個(gè)問(wèn)題是，這兩個(gè)系統(tǒng)在展示融合蛋白時(shí)要依賴體外的包裝系統(tǒng)，最好的情況下1 mg DNA允許生產(chǎn)107重組噬菌體粒子，使得突變體庫(kù)的構(gòu)建效率低下。

2.3Cry毒素突變體的篩選

盡管某些Cry毒素在噬菌體粒子上顯示效率方面存在問(wèn)題，但通過(guò)生物淘選從已經(jīng)有的噬菌體展示庫(kù)來(lái)選擇改造的Cry毒素突變體[43~45]成功的例子已知的至少有3個(gè)。第一個(gè)例子是利用T7 噬菌體系統(tǒng)來(lái)顯示Cry1Aa毒素。在結(jié)構(gòu)域Ⅱ循環(huán)2區(qū)域的突變體庫(kù)已經(jīng)建造出來(lái)，并用于恢復(fù)毒素變體來(lái)增加對(duì)蠶(Bombyxmori)的鈣粘蛋白片段的結(jié)合親和力。使用鈣粘蛋白涂磁珠，經(jīng)過(guò)5輪的選擇，結(jié)構(gòu)域Ⅱ循環(huán)2突變體與鈣粘蛋白結(jié)合的親和力有明顯的提高，與選中的Cry1Aa相比對(duì)蠶幼蟲(chóng)有高達(dá)4倍的殺蟲(chóng)活性[43]。另外兩個(gè)例子是根據(jù)基因轉(zhuǎn)移建立Cry毒素變體庫(kù)，這些變體庫(kù)在M13上得到顯示并且根據(jù)生物淘選選出與來(lái)自靶標(biāo)昆蟲(chóng)的BBMV結(jié)合的改造突變體。Cry毒素對(duì)草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)是有毒性的，但對(duì)于甘蔗巨頭鉆(Telchinlicuslicus)沒(méi)有毒性[44]。通過(guò)基因轉(zhuǎn)移而構(gòu)建的Cry1Ia突變體庫(kù)被克隆為噬菌體載體并且在M13噬菌體上顯示。從該突變體庫(kù)選擇最好的Cry1Ia并結(jié)合甘蔗巨頭鉆的BBMV，對(duì)甘蔗螟有殺蟲(chóng)活性的4個(gè)重要的突變體包括結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅲ的單個(gè)突變被恢復(fù)并且得到顯示[44]。Cry8Ka基因被認(rèn)為是一種對(duì)棉鈴象甲(Anthonomusgrandis)顯示中度毒性的毒素，Cry8Ka的基因轉(zhuǎn)移和改造提高了與棉鈴象甲BBMV的結(jié)合能力，使得突變體(Cry8Ka5)顯示出比原毒素高出3倍的毒性，該突變的改造是將一個(gè)位于被預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域Ⅱ循環(huán)3區(qū)域氨基酸N端的16個(gè)氨基酸刪除以及對(duì)6個(gè)額外氨基酸進(jìn)行改造[45]。

3展望

隨著對(duì)Cry毒素作用機(jī)制的研究， Cry毒素能夠有效地防治農(nóng)林業(yè)中的重要害蟲(chóng)。正如之前指出的，昆蟲(chóng)抗性的出現(xiàn)可能會(huì)威脅到其發(fā)揮作用。通過(guò)對(duì)Cry毒素進(jìn)行分子改造，從而提高其殺蟲(chóng)活性，同時(shí)控制不同昆蟲(chóng)目種，如鞘翅目和鱗翅目。了解Cry毒素的作用機(jī)制和昆蟲(chóng)對(duì)Cry毒素的攻擊機(jī)制，將有利于新的、更多有效分子改造的Cry毒素的發(fā)展。因此，我們可以預(yù)見(jiàn)一個(gè)光明的未來(lái)，利用分子改造的Bt Cry毒素以防治農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要害蟲(chóng)，減少對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)劑的依賴，保持一個(gè)更健康的環(huán)境。

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Progress on Molecular Modification Methods of Insecticidal Activity of Cry Toxin

GUO Ya-jie1,2, LI Ping1, WU Zhong-ling1, ZHENG Ru-ping1, ZHANG Jun1,2, HU Xia1*

1.ForestryCollege,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China;

2.KeyLaboratoryofBiopesticideandChemicalBiology,MinistryofEducation,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China

Abstract:Cry toxins produced byBacillusthuringiensis(Bt) could provide a valuable resource for efficient pest control. But insect midgut proteases could be a limiting step of Cry toxicity in different insect species. This article analyzed several different strategies of improving toxicity against a specific target, including domain Ⅲ swapping, domain Ⅱ and domain Ⅲ mutations and other mutations in Cry toxins. Furthermore, this article also expounded the phage display to optimize toxin, which improved the insecticidal toxicity against pests that show no susceptibility to the parental Cry toxins. The paper was expected to provide reference for molecular modification and application of Cry toxin.

Key words:Bacillusthuringiensis; cry toxin; evolution; molecular modification

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.01.05

作者簡(jiǎn)介：郭雅潔，本科生，主要從事微生物農(nóng)藥研究。E-mail：924327611@qq.com。*通信作者：胡霞，講師，主要從事昆蟲(chóng)與微生物的互作關(guān)系研究。E-mail：lake-autumn@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目(201510389018);福建農(nóng)林大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目建設(shè)專項(xiàng)(6112C035005)資助。

收稿日期：2015-11-24; 接受日期：2015-11-26