金　鑫,　范海麗,　陳建麗,　黃天培,　關(guān)　雄

福建農(nóng)林大學, 閩臺特色作物病蟲生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心, 教育部生物農(nóng)藥與化學重點實驗室, 福州 350002

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細菌冷激蛋白研究進展

金鑫,范海麗,陳建麗,黃天培*,關(guān)雄

福建農(nóng)林大學, 閩臺特色作物病蟲生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心, 教育部生物農(nóng)藥與化學重點實驗室, 福州 350002

摘要：冷激蛋白(cold shock protein, CSPs)是微生物受到冷刺激所誘導合成的分子量為7 kDa左右的蛋白質(zhì),它們與細胞在低溫環(huán)境下的應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。冷激蛋白的功能是作為RNA的分子伴侶與mRNA結(jié)合，阻止mRNA二級結(jié)構(gòu)的形成，從而使翻譯順利進行。主要介紹了細菌冷激蛋白的功能、應(yīng)用以及調(diào)控機制的研究進展，以期為更深入的生產(chǎn)應(yīng)用和功能等的科學研究提供參考。

關(guān)鍵詞：冷激蛋白；功能；調(diào)控機制

對于微生物而言，當環(huán)境溫度明顯低于其正常的生理溫度時，會產(chǎn)生瞬時的冷誘導反應(yīng)，影響細胞的生長速率、飽和脂肪酸的利用率以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成。當溫度驟然降低時，大多數(shù)蛋白質(zhì)的合成受到抑制，然而冷誘導蛋白(cold induced proteins, CIPs)會急劇增加。其中一些小分子量(大約7.5 kDa)的酸性蛋白質(zhì)被強烈誘導產(chǎn)生,稱之為冷激蛋白(CSPs)[1]。這些蛋白對于細胞在適應(yīng)低溫環(huán)境和發(fā)揮各種功能是極為重要的。這意味著對CSPs的研究具有廣泛且可觀的應(yīng)用價值。比如，乳酸菌作為食品工業(yè)中十分重要的菌株，許多乳酸發(fā)酵劑都需要添加冷凍的培養(yǎng)物，這對菌株的凍藏存活率有很高的要求，因此增強菌株抗凍能力的研究正在興起，對CSPs作用機制的研究則具有重大意義[2]。

1冷激蛋白的分布

CSPs的分布十分廣泛[3]，在細菌中最早研究發(fā)現(xiàn)的是大腸桿菌(Escherichiacoli)中的CspA，當大腸桿菌從37℃降到10℃培養(yǎng)時，蛋白質(zhì)合成的數(shù)量大幅度減少，細胞停止生長。2 h后，只有28種蛋白明顯產(chǎn)生，其中有14種蛋白表達量高于處理前。冷刺激3 h后，一些蛋白的表達量開始增加，直至4 h后，蛋白的表達恢復正常。CspA是冷激后首先被誘導產(chǎn)生的蛋白，也是唯一在37℃檢測不到的蛋白[4]。隨后在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了8種與CspA具有同源性的蛋白(CspB~CspI),其中只有CspA、CspB、CspE、CspG和CspI是低溫誘導產(chǎn)生的，CspC與細胞的生長調(diào)控有關(guān)，基本在37℃表達，而CspD則在穩(wěn)定期和營養(yǎng)缺乏時才會產(chǎn)生[5]。

與大腸桿菌不同，枯草桿菌(Bacillussubtilis)受到冷激后不會出現(xiàn)生長的停止，而是生長速率變得很慢。當枯草桿菌從37℃降到15℃培養(yǎng)時，在30~60 s內(nèi)有36種蛋白質(zhì)能夠被合成，經(jīng)鑒定，其中含有一個同源的酸性小蛋白家族(CspB、CspC和CspD)，其同源性大于70%，而CspA不是其成員，此時CspB成為枯草桿菌中主要的冷激蛋白[6]。CspB一般在低于20℃培養(yǎng)時才存在，但不表示在細胞正常生長時不表達，因為當枯草桿菌從生長指數(shù)期進入到穩(wěn)定期后，蛋白質(zhì)的合成方式會產(chǎn)生明顯的變化，此時，CspB和CspC這兩種同源的酸性小蛋白質(zhì)能被誘導產(chǎn)生，而CspD沒有產(chǎn)生[7]。這與大腸桿菌相比顯然是不同的。

嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)在20℃培養(yǎng)2~4 h后，CSPs的表達水平會增加3~4倍，將溫度下調(diào)至10℃培養(yǎng)，基本沒有CSPs的產(chǎn)生，這說明10℃是嗜熱鏈球菌耐受的最低溫度。嗜熱鏈球菌中最主要的CSPs是CspA，當細菌從42℃轉(zhuǎn)到20℃培養(yǎng)后,CspA的表達量會增加3倍左右，CspB、CspC、CspE等雖然都有表達，但表達量遠不如CspA[8]。

除了大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，李斯特菌(Listeria)、根瘤菌(Rhizobium)[4]、沙門氏桿菌(Salmonellaentericaserovarcyphimurium)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)[9]等均證實有CIPs的存在。

2冷激蛋白的功能

2.1冷激蛋白作為分子伴侶的功能

目前，對冷激蛋白的功能研究比較有限，普遍認為其功能是作為RNA分子伴侶與mRNA結(jié)合，起到穩(wěn)定mRNA的作用，促進翻譯順利進行。研究表明，將枯草桿菌的cspB基因敲除會對15種冷誘導蛋白的產(chǎn)生造成消極影響，這表明，CspB在受到冷刺激后能夠產(chǎn)生一種調(diào)節(jié)功能。敲除CspC和CspD基因并不會引起太大的表型變化，若將CspB、CspC、CspD3個基因敲除，只有將3基因缺失突變體重組到一個未缺失CspB的質(zhì)粒載體上，突變體才會重新生長[7]。這說明CspB對于細菌在低溫環(huán)境中的生存是十分重要的。在大腸桿菌CSPs家族中，只有CspA、CspB、CspG和CspI是冷誘導產(chǎn)生的。在指數(shù)生長前期，CspA的含量約50 μmol/L，雖然此時cspA基因的轉(zhuǎn)錄水平較高，但其mRNA穩(wěn)定性較差，并且容易發(fā)生降解；而在低溫條件下其mRNA穩(wěn)定性則很好。CspA、CspC和CspE有消除RNA二級結(jié)構(gòu)的作用，可能具有抗終止子的作用[10]。CspD的表達量在細胞生長進入穩(wěn)定期或是營養(yǎng)缺乏時就會增加，是細胞在該環(huán)境條件下生長必需的蛋白。低溫條件下，親水的mRNA會發(fā)生折疊，影響翻譯進程，而CspB的存在則能夠阻止mRNA二級結(jié)構(gòu)的形成，使翻譯順利進行[11]。CspF和CspH目前只知道其不是冷誘導的,與其他冷激蛋白結(jié)構(gòu)明顯不同，但其功能未知；CspI功能也未知。

2.2冷激蛋白的生理功能及應(yīng)用

冷激蛋白的生理功能具有多樣性。近年來國內(nèi)外學者針對冷激蛋白的應(yīng)激應(yīng)用有較多研究。將戈壁異常球菌(Deinococcusgobiensis)I-0的Csp1基因?qū)氲酱竽c桿菌Trans 109中表達，能提高大腸桿菌對低溫、高鹽、干旱等逆境的適應(yīng)性[12]。將耐輻射異常球菌(DeinnoccusradioduransDR1)中編碼冷激蛋白Csp2的基因轉(zhuǎn)入到甘藍型油菜中，能提高甘藍型油菜種子抵御干旱脅迫的能力[13]。將枯草芽孢桿菌XS-01的CspB基因轉(zhuǎn)入煙草中，得到干旱脅迫后恢復力顯著增強的轉(zhuǎn)基因煙草[14]。孟山都公司將大腸桿菌的cspA基因和枯草芽孢桿菌的cspB基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中，得到了抗寒能力顯著增強的轉(zhuǎn)基因品系；將cspA和cspB基因轉(zhuǎn)入到水稻中，得到了對低溫、高溫、干旱等對逆境脅迫的耐受能力顯著提高的轉(zhuǎn)基因水稻；將cspB基因轉(zhuǎn)入到玉米中，在2009-2011年的田間試驗中，缺水條件下這種轉(zhuǎn)基因玉米較傳統(tǒng)品種產(chǎn)量增加了6%[15,16]。

3冷激蛋白的調(diào)控機制

3.1mRNA穩(wěn)定性

大腸桿菌CspA的mRNA存在一個長150 bp的5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)，對mRNA的穩(wěn)定性有著重要的影響，大腸桿菌的CspA在溫度驟降之后的2 h內(nèi)可以瞬時表達。其中，CspA mRNA的5′-UTR在CspA的表達調(diào)控中起著關(guān)鍵性的作用。37℃時mRNA半衰期極短且不穩(wěn)定，對CspA的表達產(chǎn)生了消極影響，當培養(yǎng)溫度由37℃降到15℃時，半衰期暫時延長，mRNA折疊量增加，穩(wěn)定性升高[17]。將5′-UTR內(nèi)3個堿基替換掉會導致CspA的mRNA穩(wěn)定性在37℃提高150倍，這可以說明CspA的啟動子在37℃時是比較活躍的，推測認為這種穩(wěn)定性的增加可能是由于其對RNase的降解產(chǎn)生了抗性[18]。

3.2冷框

進一步研究發(fā)現(xiàn)CSPs 5′-UTR中有一段長為11個核苷酸的保守序列，稱其為冷框(cold box)，冷框的存在可以增強CspA mRNA的穩(wěn)定性，促進冷激蛋白的表達，若將冷框敲除則會導致mRNA穩(wěn)定性顯著降低，CspA的表達受到抑制，這說明冷框在CIPs的轉(zhuǎn)錄水平起到重要的調(diào)控作用。冷框的作用主要取決于其莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖部的完整程度，這個片段的縮短、缺失或突變都會導致CspA的表達量明顯下降。其莖環(huán)后方AU序列的缺失會使CspA mRNA的穩(wěn)定性增強，半衰期延長，造成這一現(xiàn)象可能的原因是此區(qū)域含有RNaseE的酶切位點。研究表明，CspA的mRNA與核糖體的結(jié)合位點即為冷框，當冷框過量表達時，可與核糖體結(jié)合，使低溫條件下CspA mRNA的5′-UTR與核糖體有很強的親和性并優(yōu)先表達[19,20]。

3.3CSPs自身

通常核苷酸二級結(jié)構(gòu)的形成，會阻止轉(zhuǎn)錄的進行,從而影響翻譯，而CSPs作為RNA分子伴侶，能與處于單鏈狀態(tài)的RNA或DNA結(jié)合，具有消除核苷酸二級結(jié)構(gòu)的作用，保證轉(zhuǎn)錄的順利進行，起到調(diào)節(jié)表達的作用。

3.4DB框

Csps除了消除mRNA的二級結(jié)構(gòu)、促進蛋白翻譯，還存在其他增強自身翻譯的機制，如大腸桿菌的CspA存在另一種增強其自身翻譯的機制：在CspA的mRNA上存在一個順式作用元件DB框(down stream)，它是一個位于翻譯起始密碼子下游12 bp處的一段長14 bp的保守序列，可以與16S rRNA的一段序列互補，增強SD序列與核糖體的結(jié)合，它對消除細胞冷刺激后翻譯受到的抑制起關(guān)鍵作用，在DB框的幫助下，CspA的mRNA翻譯可能不需要冷誘導特異的核糖體因子(如CsdA和RbfA)參與就可以完成[21]。

4展望

大量研究證實,冷激蛋白的重要功能在于其能減輕溫度驟降對微生物傷害，對微生物適應(yīng)低溫生長環(huán)境起著關(guān)鍵作用，目前對于其結(jié)構(gòu)研究的比較徹底，而對于溫度的敏感性、冷激蛋白確切的生理作用和冷誘導的調(diào)控以及與其他環(huán)境刺激的交互作用仍需進一步深入研究。研究表明，冷激蛋白的生理功能具有多樣性，將冷激蛋白的冷激基因用于生物體性狀改良，能提高菌株及作物對低溫、高溫、干旱等逆境的適應(yīng)性，體現(xiàn)了冷激蛋白和冷激基因廣泛的實際應(yīng)用潛力，也間接證明了冷激蛋白在食品、農(nóng)產(chǎn)品和生物資源等方面具有極高的應(yīng)用價值。

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Progress on Bacterial Cold Shock Proteins

JIN Xin, FAN Hai-li, CHEN Jian-li, HUANG Tian-pei*, GUAN Xiong

KeyLaboratoryofBiopesticideandChemicalBiology,MinistryofEducation,Fujian-TaiwanJointCenterforEcologicalControlofCropPests,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China

Abstract:Cold shock proteins (CSPs) is the 7 kDa small protein that bacteria responsing to low temperature. CSPs is closely related to cell cold response. CSPs may function as RNA chaperones, as they possess binding mRNA. In this way they could minimize the secondary folding of mRNA, thereby facilitating the translation process. This article reviewed the function, application and mechanism of regulation of CSPs, which was expected to provide reference for further study on the application and function of CSPs.

Key words:cold shock protein; function; regulation

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.01.03

作者簡介：金鑫，碩士研究生，主要從事微生物藥物方面研究。E-mail：jinqiaoyi1215@163.com。*通信作者：黃天培，副研究員，碩士生導師，主要從事微生物藥物方面研究。E-mail：tianpeihuang@fafu.edu.cn

基金項目：國家863計劃項目(2011AA10A203);福建省2011年協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目(閩教科[2013]51號);高校領(lǐng)軍人才項目(k8012012a)資助。

收稿日期：2015-10-29; 接受日期：2015-12-02