何蕊純，何玉華※，孟　巖,趙金權(quán)

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林132101；2.吉林省梨樹縣勝利鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，梨樹136500）

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三種色型（野生色型、白色型、紅褐色型）烏蘇里貉的遺傳學(xué)研究進(jìn)展

何蕊純1，何玉華1※，孟巖1,趙金權(quán)2

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林132101；2.吉林省梨樹縣勝利鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，梨樹136500）

摘要：對野生色型、白色型、紅褐色型烏蘇里貉的染色體數(shù)目、基因型、相關(guān)毛色基因MC1R、MC4R、POUIF1、FSHβ 和FSHR、TYRP1、KIT的克隆及序列分析進(jìn)行了歸納總結(jié)。吉林白貉的染色體眾數(shù)為56或57，紅褐色型烏蘇里貉和野生色型烏蘇里貉體細(xì)胞染色體眾數(shù)都是56。野生色型、吉林白貉、紅褐色烏蘇里貉的基因型分別為Ww、ww、Gg。紅褐色烏蘇里貉的毛色主要與MC1R基因有關(guān)，與白毛色形成的基因為KIT基因。

關(guān)鍵詞：三種色型；烏蘇里貉；染色體；基因型；毛色基因

※為本文通訊作者

貉屬于食肉目、犬科、貉屬的一種珍貴毛皮動物。據(jù)1941年衣川義雄報道，在我國貉可分為七個亞種：烏蘇里貉、朝鮮貉、阿穆爾貉、江西貉、閩粵貉、湖北貉、云南貉[1]。據(jù)1987年《中國動物志》的記載，我國的貉可分為三個亞種，即指名亞種、東北亞種、西南亞種[2]。從我國毛皮動物飼養(yǎng)的種類和數(shù)量上看，烏蘇里貉的飼養(yǎng)數(shù)量較大、分布的范圍較廣，而且烏蘇里貉的總飼養(yǎng)量已超越芬蘭，成為世界第一養(yǎng)貉大國，烏蘇里貉養(yǎng)殖區(qū)域分布在北方各個省份，烏蘇里貉產(chǎn)于大興安嶺、長白山、三江平原、南北平原等地。烏蘇里貉的野生型毛色一般為青灰或者青黃色，被毛長而蓬松，底絨豐厚。以東三省皮質(zhì)為上乘，貉皮特有的生物特性是其他皮張所不能取代的。

在長期的飼養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，烏蘇里貉的毛色可以發(fā)生多種變異，國內(nèi)發(fā)現(xiàn)笫一只白貉是在l974年，l980年又在黑龍江地區(qū)養(yǎng)殖戶中發(fā)現(xiàn)了繁殖出的白貉，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所利甪這些寶貴的白貉突變基因，經(jīng)過l0多年的研究培育成的白色新類型貉，命名為“吉林白貉”。吉林白貉是野生色型的烏蘇里貉毛色發(fā)生突變的一種，與野生色型的烏蘇里貉相比較，吉林白貉的針毛和絨毛均為白色，但眼圈、耳緣、鼻尖、爪和尾尖是黑色。山東莒南于2006年又發(fā)現(xiàn)烏蘇里貉的又一個毛色變異——紅褐色貉[3]。紅褐色貉被毛的特點為：紅褐色毛尖、白色底絨，但眼睛和吻均為粉紅色。在當(dāng)今的毛皮市場上來看，吉林白貉和紅褐色烏蘇里貉均具有廣泛的飼養(yǎng)前景和銷售市場。

1　三種色型烏蘇里貉的染色體數(shù)情況與比較

很多國內(nèi)外學(xué)者對三種色型的烏蘇里貉的遺傳學(xué)進(jìn)行了研究，最早的當(dāng)屬對野生色型的烏蘇里貉的研究。IZABELA[4]的研究表明，野生色型烏蘇里貉(N．P procyonoides)的二倍體染色體數(shù)目是54-58，但56和57數(shù)量較多，比例分別為68.6％ 和16.45％。Ward O G[5]認(rèn)為關(guān)于中國貉的二倍體染色體數(shù)目為56或57；還有報道表明貉的二倍體染色體數(shù)目為56[6-7]。

李延鵬[8]利用外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法制備染色體標(biāo)本，對紅褐色烏蘇里貉、野生烏蘇里貉和吉林白貉這3種毛色烏蘇里貉的染色體數(shù)目進(jìn)行比較，得出的結(jié)論為：野生色型、紅褐色型、白色型烏蘇里貉的二倍體細(xì)胞染色體數(shù)為56的細(xì)胞頻率分別為83％、86％、70％；野生烏蘇里貉、紅褐色烏蘇里貉染色體眾數(shù)均為56；吉林白貉的染色體眾數(shù)為56或57，其染色體數(shù)目存在多態(tài)現(xiàn)象。

本研究是國內(nèi)首次將這3種色型烏蘇里貉染色體數(shù)目的異同點進(jìn)行比較，為建立3種色型貉生物學(xué)特性數(shù)據(jù)庫和查找紅貉毛色突變的原因提供依據(jù)。

2　三種毛色烏蘇里貉基因型

烏蘇里貉毛色遺傳屬隱形性基因遺傳，個體均為純合基因型(ww)。

吉林白貉毛色遺傳屬顯性基因遺傳，個體均為雜合基因型(Ww)。

紅褐色烏蘇里貉在依據(jù)孟德爾遺傳定律，對不同選配組合后代毛色分離數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和ⅹ2適合性檢驗證明，其突變棕色毛色基因為顯性，基因型為雜合體。建議其基因符號用“G”表示，基因型為“Gg”[9]。

3　相關(guān)毛色基因的克隆及序列分析

3.1MC1R

MC1R是促黑素細(xì)胞激素受體，屬于G-蛋白偶聯(lián)受體，具有7次跨膜結(jié)構(gòu)，是一種肽類物質(zhì)，具有317個氨基酸[10]。該受體與哺乳動物毛色的形成有重要關(guān)系，通過與Agouti蛋白或內(nèi)源配體中的促黑激素結(jié)合，調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞的功能，進(jìn)而合成黑色素。

孫靜[10]提取了紅褐色烏蘇里貉毛囊組織DNA，通過PCR擴(kuò)增，得到了紅褐色貉MC1R基因，獲取的序列長度為1329bp，與已知序列進(jìn)行比較后得出同源性98％，突變?yōu)?3處，和野生型同源性比較達(dá)到99％，檢測到了829bp 820bp、793bp、569bp、474bp、452bp、439bp、274bp共8個變異位點，其中在439bp處的編碼第53位Pro的第三密碼子發(fā)生無義突變A→G；以下氨基酸的序列錯義突變：Ala829 Glu，Arg820 His，Arg793 Cys，Arg569 Cys，Arg474 Leu，Val452 Ala Gln274 Arg，推測紅褐色的出現(xiàn)是由于MC1R基因具有相關(guān)的功能突變位點，從而導(dǎo)致毛色突變。

MC1R基因通過酶切鑒定在約300bp處酶切得到AB、BB兩種基因型，AB型屬于紅褐色貉，BB型屬于野生型貉。

RT-PCR結(jié)果表明，紅褐色貉與銀黑狐、吉林白貉、與野生色型貉的毛囊中的表達(dá)量相一致。

3.2MC4R

MC4R基因的主要功能是能夠控制動物的體重、食欲、能量代謝。MC4R同樣屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員之一，G蛋白偶聯(lián)受體共有5個亞型：MC1R在黑素細(xì)胞表達(dá)，參與動物的毛色形成；MC2R在腎上腺皮質(zhì)表達(dá)；MC3R在腸道、大腦、胎盤表達(dá)；MC4R在下丘腦表達(dá)；MC5R在外分泌組織表達(dá)[11]。

王星[11]對烏蘇里貉MC4R的研究結(jié)果表明：烏蘇里貉MC4R基因與赤狐、北極狐犬、貉這幾種犬科動物在該編碼區(qū)核苷酸序列上的同源性在98.7％-99.7％之間，與小鼠、大鼠、豬、牛、非洲象、黑猩猩、人的同源性在86.2％-89.5％之間，不同物種間在該基因核苷酸序列上保守性較高。通過MC4R核苷酸序列對20種動物進(jìn)行的聚類分析結(jié)果顯示，斑馬魚與雞為一松散類群，哺乳動物與犬科動物為一緊密類群，符合公認(rèn)的動物分類及進(jìn)化關(guān)系。潘寶麗[12]克隆了貉子整個MC4R基因共1239bp。

3.3POUIF1

POUIF1基因是非常重要垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子，其主要在垂體前葉腺中表達(dá)。對動物的生長具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，POUIFI可以作為反式因子來激活PRL、GH、TSHp基因β亞基的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而對PRL、GH、TSHp的表達(dá)起到?jīng)Q定性作用。

潘寶麗[12]克隆了貉子PouIF1基因第4外顯子，序列長度別為150bp，將所測序列通過GeneBank中的Blast比較分析，此段序列與犬、牛、人和黑猩猩、褐鼠、斑馬魚、雞的同源性分別為：100％、94％、92％、88％、84％、83％。并進(jìn)行多態(tài)性檢測，在不同試驗個體中均未檢測出多態(tài)。說明該位點突變并未引起貉子體重的改變。

3.4FSHβ和FSHR

FSH（促卵泡素）與黃體生成素組成促性腺激素，其功能是能夠促進(jìn)卵泡發(fā)育和成熟、促進(jìn)雌激素的分泌。

FSHβ是FSH基因的兩個亞基其中的一個，外顯子具有3個，外顯子2和部分外顯子3序列位于編碼區(qū)。FSH基因包括α和β兩個亞基，β亞基屬于特異的功能亞基，它主要的作用是參與加受體結(jié)合。

FSHR是位于卵巢顆粒細(xì)胞膜上的促卵泡素受體，F(xiàn)SH基因通過受體來進(jìn)行功能的發(fā)揮，F(xiàn)SH屬于生物大分子，不用經(jīng)過FSHR就能透過細(xì)胞膜。

楊建[13]對野生和家養(yǎng)烏蘇里貉的FSHβ基因部分序列、FSHR基因5’端上游調(diào)控區(qū)和外顯子10進(jìn)行擴(kuò)增和測序。獲得序列長度分別為1257bp、757bp、1398 bp，經(jīng)BLAST比較分析與犬的同源性分別為99％、98％和98％。

利用DNAMAN軟件對2只野生與2只家養(yǎng)貉進(jìn)行多序列比對，結(jié)果分析，3個基因片段中分別檢測到12、10和3個變異位點，其中編碼區(qū)堿基的突變位點分別有2、1和0個；將2只家養(yǎng)貉的序列相比后分別有2、1和0個多態(tài)位點，而2只野生貉有6、9和3個多態(tài)位點，說明野生貉比家養(yǎng)貉的遺傳多樣性更明顯。

3.5TYRP1

TYRP1基因在黑色素的生成過程中具有重要作用。TYRP1（Tyr酶相關(guān)蛋白1）基因是Tyr酶家族的成員，在色素基因中為第1個被成功克隆的，定位于小鼠的brown位點，包括內(nèi)含子7個和外顯子8個[14]。狗的TYRP1基因在第11號染色體有7個內(nèi)含子和8個外顯子[15]。TYRP1從基因調(diào)控的角度來看，TYRP1可以上調(diào)Tyr合成酶（TYR）的活性[16]，TYR對黑色素的合成至關(guān)重要，TYR活性高的話會導(dǎo)致真黑素產(chǎn)生。

朱艷菲[17]克隆了野生色型和紅褐色型烏蘇里貉TYRP1基因CDS序列，經(jīng)RT-PCR技術(shù)對TYRP1基因在2種毛色貉中的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了分析：2種貉TYRP1基因CDS序列全長1614 bp，共編碼537個氨基酸；紅褐色烏蘇里貉TYRP1基因編碼序列與人、黑猩猩、狗、豬、馬、綿羊、牛、貓、小鼠、虎鯨的核酸序列的同源性比較范圍在99.07％- 83.22％之間，相似性較高。利用SPSS19.0進(jìn)行獨立樣本t檢驗，結(jié)果表明TYRP1基因可以在2種貉的皮膚組織中穩(wěn)定表達(dá)，利用F=（1+E）－△△Ct計算可知TYRP1基因在紅褐色烏蘇里貉中的表達(dá)量是野生型烏蘇里貉的0.93倍，但差異不顯著（P>0.05）。

3.6KIT

KIT基因是控制毛色的主要基因之一，屬于白色基因座，KIT基因編碼黑色素細(xì)胞前體的“肥大/干細(xì)胞生長因子受體”，黑色素細(xì)胞前體物正常遷移與存活被擾亂都是由于該基因發(fā)生突變引起的，后果是使毛根中黑色素細(xì)胞及其前體物的缺失，就會出現(xiàn)白色毛[18]。據(jù)報道，由于KIT基因突變能引起斑駁病，該突變還能導(dǎo)致KIT受體的功能發(fā)生改變，使酪氨酸激酶的功能減退或部分的喪失，這樣使斑駁病在臨床上出現(xiàn)特有的癥狀[19]。Haase等[20]通過對白色和有色Franches-Montagnes馬的KIT基因進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)了一個能夠阻止KIT基因的產(chǎn)物，并導(dǎo)致白馬皮膚黑色素細(xì)胞缺失的突變。

資料顯示由于KIT基因G→A的突變以及AGTT缺失導(dǎo)致榮昌豬形成白色毛[21]。另外，KIT基因與海福特牛毛色的六白特征有顯著相關(guān)性[22]。

據(jù)報道紅褐色烏蘇里貉KIT基因第二外顯子與犬、狐、家貓、虎鯨、野豬、馬的同源性分別為97％，97％，92％，89％，87％，87％；對野生型烏蘇里貉、紅褐色烏蘇里貉和吉林白貉KIT基因第二外顯子序列進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，3種貉序列完全匹配，說明在此處沒有發(fā)生突變[23]。

4　小結(jié)

吉林白貉的染色體眾數(shù)為56或57，紅褐色貉和野生貉為56。野生色型貉、白貉、紅褐色烏蘇里貉的基因型分別為：Ww、ww、Gg。

相關(guān)研究表明，導(dǎo)致紅褐色型烏蘇里貉、吉林白貉毛色發(fā)生改變的原因很多，其中比較重要的因素是毛色基因。與毛色有關(guān)的主要基因有MC1R、MC4R、POUIF1、FSHβ和FSHR、TYRP1、KIT等。紅褐色烏蘇里貉的毛色主要與MC1R基因有關(guān)，并從中檢測到了8個異變位點。與白毛色形成的基因為KIT基因，但對三種色型的烏蘇里貉KIT基因第二外顯子進(jìn)行了比較分析，沒有發(fā)現(xiàn)與毛色相關(guān)的位點突變，但其是否存在毛色相關(guān)的突變位點，還有待進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：吳艷玲

Research Progress on Genetics of Wusuli Racoon Dog of Three Kinds of Color Type (wild type,white type,red brown type)

HE Ruichun1，HE Yuhua1，MENG Yan1，ZHAO Jinquan2
（1.Jilin Agricultural Science and Technology University School of Animal Science and Technology,Jilin 132101; 2.Animal Husbandry and Veterinary Station of Victory Township Lishu County in Jilin Province,Lishu 136500）

Abstract：The chromosome number,Gene type,Cloning and sequence analysis of the related coat color gene (MC1R,MC4R,POUIF1,FSH beta and FSHR,TYRP1,KIT) of three kinds of color patterns of Wusuli racoon dog were summarized,in this paper.The chromosome mode of Jilin white raccoon dog was 56 or 57,the chromosome mode of red brown Wusuli raccoon dogs and wild Wusuli raccoon dog were 56.The genotype of wild color type racoon dog,Jilin white racoon dog,red brown Wusuli racoon dog procyonoides were Ww,WW,Gg.Red brown Wusuli raccoon coat color was mainly associated with the MC1R gene.The KIT gene was associated with white hair

Key words：three kinds of color; Wusuli raccoon dog; chromosome; genotype; coat color gene

作者簡介：何蕊純（1992-），女，吉林省長春市人，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院2013級野生動物與自然保護(hù)區(qū)管理專業(yè)學(xué)生。

基金項目：吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項目（2015第053號）；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院長白山動植物資源利用與保護(hù)吉林省高校重點實驗室項目（2014第S011號）

收稿日期：2015-11-01

中圖分類號：S865.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A