洪閣 紀(jì)?，?龐麗云 蘇喆 劉天軍

300192天津，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

陽離子卟啉衍生物的體外光動力抗菌活性研究

洪閣 紀(jì)?，?龐麗云 蘇喆 劉天軍

300192天津，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的 研究陽離子卟啉衍生物介導(dǎo)的光動力抗菌化學(xué)療法（CPD-PACT）對體外培養(yǎng)的綠膿桿菌的抑制作用，為研究其高效的抗菌作用特點(diǎn)提供依據(jù)。方法 采用二倍稀釋法考察培養(yǎng)條件對CPD最小抑菌濃度（MIC）的影響，擴(kuò)散法測定CPD的抑菌圈，活菌計數(shù)法測定CPD的體外抗菌后效應(yīng)，并通過激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察綠膿桿菌的活力和形態(tài)變化。結(jié)果 細(xì)菌接種量對MIC值存在一定的影響；培養(yǎng)基pH值的升高會使化合物的MIC值相應(yīng)升高；血清蛋白體積分?jǐn)?shù)的增加會使光反應(yīng)的MIC值升高，而暗反應(yīng)的MIC值降低。抑菌圈的大小主要取決于激光能量密度的強(qiáng)弱，而受光敏劑濃度的影響較小。CPD對綠膿桿菌有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用，且存在明顯的抗菌后效應(yīng)，但光療結(jié)束后存活的細(xì)菌會繼續(xù)增殖。CLSM觀察結(jié)果表明，CPD-PACT可破壞細(xì)菌外膜完整性，使細(xì)菌內(nèi)容物泄露，活力減弱，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。結(jié)論CPD-PACT對綠膿桿菌具有高效的抗菌活性和明顯的抗菌后效應(yīng)，適合作為新一代抗菌候選藥物進(jìn)行深度開發(fā)。

陽離子卟啉衍生物； 綠膿桿菌； 光動力抗菌； 抑菌活性

Fund program:Key Technology Research and Development Program of Tianjin(12ZCDZSY11900); Fundamental Research Funds for the Central Universities(1517);Open Project of Key Laboratory of Disaster& Emergency Rescue Medicine in People's Liberation Army(JY1405)

0 引言

綠膿桿菌又稱銅綠假單胞菌，是一種無芽孢的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界及正常人的皮膚、呼吸道和腸道中。當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時（如大面積燒傷、創(chuàng)傷等），綠膿桿菌易引發(fā)肺炎、中耳炎、腦膜炎、尿道炎、膿毒癥和敗血癥等繼發(fā)感染類疾病。目前，臨床上治療綠膿桿菌感染的藥物主要是抗生素。近年來，由于抗生素的不合理使用和細(xì)菌的變異導(dǎo)致綠膿桿菌出現(xiàn)獲得性耐藥，甚至多重耐藥，給臨床抗感染治療帶來了極大的挑戰(zhàn)[1]。因此，尋找新的抗感染策略和抗菌藥物迫在眉睫。

光動力抗菌化學(xué)療法（photodynamic antimicrobial chemotherapy,PACT）是目前最具前景的新療法之一，其原理是利用光敏劑在適當(dāng)波長的光照射下，與生物組織中的分子氧反應(yīng)，生成單線態(tài)氧、自由基等活性氧成分，從而殺滅機(jī)體內(nèi)的病原微生物。與傳統(tǒng)的抗生素治療相比，PACT具有抗菌譜廣、細(xì)菌選擇性強(qiáng)、毒副作用低、不易產(chǎn)生耐藥性、可用于局部治療等諸多優(yōu)勢[2]，有望成為一種專門治療耐藥菌感染的新型替代療法[3-6]。光、光敏劑和氧是PACT必備的3個基本要素，其中光敏劑是PACT的關(guān)鍵。本研究主要介紹一種新型的陽離子卟啉衍生物（cationic porphyrin derivative,CPD）光敏劑——5,10,15，20-四{4-[（S）-2，6-二氨基己酰胺基]苯基}卟啉（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1）及其對體外培養(yǎng)的綠膿桿菌的抗菌活性，并初步探討其可能的抗菌作用機(jī)制，為其在臨床外傷感染治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

綠膿桿菌（ATCC27853）（武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院災(zāi)害應(yīng)急救援醫(yī)學(xué)全軍重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈予），CPD（深紫色固體粉末，經(jīng)HPLC檢測純度＞98%）（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所分子設(shè)計與納米技術(shù)實(shí)驗(yàn)室自行合成），LIVE/DEAD細(xì)菌活力檢測試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）。LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0 g，酵母提取物0.5 g，氯化鈉0.5 g，加入100 ml蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4，高壓滅菌，置于4℃保存?zhèn)溆?。LB固體培養(yǎng)基（瓊脂平板）：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，加入1 000 ml蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4，高壓滅菌，倒入有蓋的培養(yǎng)皿中，使瓊脂凝固，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HF90 CO2培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），1110離心機(jī)（德國Hettich公司），3001多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy,CLSM）（德國Carl Zeiss公司），7404型半導(dǎo)體激光器（美國Intense公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌懸液的制備

取-80℃凍存的綠膿桿菌100 μl接種于10 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床中培養(yǎng)至對數(shù)生長期；將菌液劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床中培養(yǎng)過夜；再以LB液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 光敏劑溶液的配制

精密稱取CPD固體粉末11.9mg，用少量水溶解，定容至1 ml，得濃度為1×104μmol/L的CPD母液，4℃避光保存，實(shí)驗(yàn)時以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）稀釋CPD母液至所需濃度。

運(yùn)用擬人手法編出這一段菊花與主人公的對話，這是菊花對主人公的提問，因?yàn)榫栈ú荒軓拇蟮匚震B(yǎng)分而衰弱下去，這是表現(xiàn)菊花對大地的渴望。這話也是主人公即作者中野重治的自白。被帶到監(jiān)獄里來，被和人民大眾隔離，監(jiān)獄的生活又很艱苦，可以理解為作者也不能從大地吸收養(yǎng)分的比喻。巧妙地借菊花的口把這話說出來表達(dá)自己的思念勞苦大眾的內(nèi)心。

1.2.3 不同培養(yǎng)條件對CPD抑菌活性的影響

取制備好的細(xì)菌懸液用LB液體培養(yǎng)基稀釋成2×105CFU/ml，取稀釋后的菌液和不同濃度的光敏劑溶液各100 μl加入96孔板中，使最終反應(yīng)液中CPD的濃度依次為 250.00、125.00、62.50、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 μmol/L，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔；同時設(shè)無藥對照孔（只加菌液，不加光敏劑溶液）和無菌對照孔（只加LB液體培養(yǎng)基），混勻后37℃暗孵育30 min；以波長為650 nm的紅色激光進(jìn)行照射，激光能量密度為3 J/cm2，光照時間為30 min，暗反應(yīng)則無光照過程；光照結(jié)束后，37℃培養(yǎng)18 h，觀察細(xì)菌生長情況，無肉眼可見細(xì)菌生長的最低藥物濃度即為 CPD對綠膿桿菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）。

按上述方法，在測定過程中分別將細(xì)菌接種量設(shè)為108、107、106、105、104、103CFU/ml；LB液體培養(yǎng)基的pH值設(shè)為5、6、7、8、9；血清蛋白的體積分?jǐn)?shù)設(shè)為0、25%、50%、75%，測定CPD在不同細(xì)菌接種量、培養(yǎng)基pH值和血清蛋白體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)條件下的抑菌效果。

1.2.4 抑菌圈的測定

按文獻(xiàn)[3]測定抑菌圈：取制備好的細(xì)菌懸液用LB液體培養(yǎng)基稀釋成2×107CFU/ml，再將稀釋后的菌液和不同濃度的光敏劑溶液等體積混合，使最終反應(yīng)液中CPD的濃度依次為 62.50、31.25、15.62 μmol/L，無藥對照組則以PBS代替光敏劑溶液，混勻后37℃暗孵育30 min；吸取上述反應(yīng)液100 μl，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基中；以波長為650 nm的紅色激光進(jìn)行照射，激光能量密度分別為0、64、128、192 J/cm2，光照時間分別為0、10、20、30 min，光斑直徑為1 cm；光照結(jié)束后，37℃培養(yǎng)18 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑（mm）。

1.2.5 體外抗菌后效應(yīng)的測定

取制備好的細(xì)菌懸液用LB液體培養(yǎng)基稀釋成2×105CFU/ml，再將稀釋后的菌液和不同濃度的光敏劑溶液等體積混合，使最終反應(yīng)液中CPD的濃度依次為3.91、1.95、0.98、0.49、0.24 μmol/L，無藥對照組則以PBS代替光敏劑溶液，混勻后37℃暗孵育30 min；以波長為650 nm的紅色激光進(jìn)行照射，激光能量密度為3 J/cm2，光照時間為30 min；光照結(jié)束后0、1、2、4、8、12、24 h，分別吸取100 μl反應(yīng)液，以培養(yǎng)液10倍系列稀釋，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，每個稀釋度涂布3次，37℃培養(yǎng)18 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。以各時間點(diǎn)菌落數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，光照后的孵育時間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)菌恢復(fù)生長動力學(xué)曲線，并按以下公式計算各濃度組的體外抗菌后效應(yīng)（postantibiotic effect,PAE）

PAE=T-C

式中：T為各實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)量（CFU/ml）高于光療結(jié)束時10倍所需的時間（h），C為對照組細(xì)菌數(shù)量（CFU/ml）高于光療結(jié)束時10倍所需的時間（h）。1.2.6 SYTO9/碘化丙啶染色法檢測細(xì)菌活力

取制備好的細(xì)菌懸液用LB液體培養(yǎng)基稀釋成2×107CFU/ml，再將稀釋后的菌液和光敏劑溶液等體積混合，使最終反應(yīng)液中CPD濃度為7.81 μmol/L，無藥對照組則以生理鹽水代替光敏劑溶液，混勻后37℃暗孵育30 min；以波長為650 nm的紅色激光進(jìn)行照射，激光能量密度為3J/cm2，光照時間為30min；光照結(jié)束后，9 000 r/min離心5 min，棄上清；沉淀用生理鹽水洗滌2次，9000r/min離心5min；加1ml生理鹽水重懸沉淀，再加入1.5 μl濃度為3.34 mmol/L的SYTO9和1.5 μl濃度為20 mmol/L的碘化丙啶（propidium iodide,PI），室溫避光孵育15 min后加至共聚焦培養(yǎng)皿中，避光晾干；最后用CLSM觀察細(xì)菌的形態(tài)變化和微觀結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)條件對CPD抑菌活性的影響

細(xì)菌接種量對MIC值的影響如表1所示：隨著細(xì)菌接種量的增加，CPD對綠膿桿菌的MIC值有一定的影響；當(dāng)細(xì)菌接種量為103～105CFU/ml時，CPD對綠膿桿菌光反應(yīng)和暗反應(yīng)的MIC值均無變化；當(dāng)細(xì)菌接種量為106～108CFU/ml時，光反應(yīng)的MIC值有所升高，且只有接種量為108CFU/ml時暗反應(yīng)的MIC值升高了3倍。培養(yǎng)基pH值對MIC值的影響如表2所示：隨著培養(yǎng)基pH值的升高，CPD對綠膿桿菌的MIC值也增大；當(dāng)pH值為5時，光反應(yīng)和暗反應(yīng)的MIC值均很小，推測該pH環(huán)境不適宜綠膿桿菌的生長；而當(dāng)pH值升至9時，光反應(yīng)的MIC值較pH為6～7時約升高了7倍，暗反應(yīng)的MIC值升高了1倍，說明堿性環(huán)境會減弱CPD對綠膿桿菌的抑菌效果。培養(yǎng)基中血清蛋白體積分?jǐn)?shù)對MIC值的影響如表3所示：隨著血清蛋白體積分?jǐn)?shù)的增加，CPD對綠膿桿菌光反應(yīng)的MIC值也升高，而暗反應(yīng)的MIC值則有所降低；當(dāng)培養(yǎng)基中血清蛋白的體積分?jǐn)?shù)升至25%、50%和75%時，光反應(yīng)的MIC值與血清蛋白體積分?jǐn)?shù)為0時相比分別升高了約7倍、7倍和15倍，而暗反應(yīng)則分別降低了約87.5%、87.5和75.0%。

表1 細(xì)菌接種量對MIC值的影響（μmol/L）

表2 培養(yǎng)基pH值對MIC值的影響（μmol/L）

表3 培養(yǎng)基中血清蛋白體積分?jǐn)?shù)對MIC值的影響（μmol/L）

2.2 抑菌圈的測定

CPD濃度和激光能量密度對綠膿桿菌抑菌圈直徑的影響見表4。結(jié)果表明：隨著激光能量密度的增強(qiáng)，CPD對綠膿桿菌的抑菌圈直徑也逐漸增大；當(dāng)激光能量密度為0時，光敏劑沒有抑菌圈，提示無抗菌效果；當(dāng)激光能量密度增強(qiáng)至64、128、192 J/cm2時，光敏劑的抑菌圈直徑相應(yīng)增大，分別為15、20、25 mm；當(dāng)激光能量密度相同時，光敏劑的抑菌圈直徑也相同。因此，在一定的濃度范圍內(nèi)（15.62～62.50 μmol/L），光敏劑的抑菌圈直徑主要取決于激光能量密度的強(qiáng)弱，而受光敏劑濃度的影響較小。

表4 陽離子卟啉衍生物濃度和激光能量密度對綠膿桿菌抑菌圈直徑的影響（mm）

2.3 體外PAE的測定

經(jīng)不同濃度的CPD介導(dǎo)的PACT（CPD-PACT）后，綠膿桿菌恢復(fù)生長的情況見圖2。當(dāng)CPD的濃度為0～0.49 μmol/L時，光療結(jié)束時細(xì)菌數(shù)量未明顯減少，PAE值為0～1.5 h；當(dāng)CPD的濃度為0.98～1.95 μmol/L時，光療結(jié)束時細(xì)菌數(shù)量明顯減少，PAE值為1.5～2.5 h；當(dāng)CPD的濃度為3.91 μmol/L時，光療結(jié)束時細(xì)菌已全被殺死。因此，CPD-PACT對綠膿桿菌存在明顯的抗菌后效應(yīng)（PAE），且PAE值呈濃度依賴性，隨著光敏劑濃度的增大，存活細(xì)菌數(shù)量逐漸減少，體外PAE時間逐漸延長。當(dāng)光療結(jié)束2 h后，各實(shí)驗(yàn)組存活的細(xì)菌會繼續(xù)增殖，經(jīng)對數(shù)生長期到達(dá)平臺期。

2.4 綠膿桿菌活力的檢測

在CLSM下，無藥對照組的細(xì)菌在明場圖像中呈桿狀分布，輪廓清晰，外觀飽滿，并在熒光圖像中呈明顯的綠色熒光（SYTO9），無紅色熒光信號（PI），說明樣本中均為活菌；CPD-PACT組的細(xì)菌在明場圖像中呈團(tuán)狀分布，輪廓模糊，大部分細(xì)菌胞壁破裂，內(nèi)容物泄露，并在熒光圖像中呈紅綠相間的熒光信號，說明部分細(xì)菌死亡，部分細(xì)菌存活，兩者數(shù)量基本相當(dāng)。（圖3）

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著新的耐藥機(jī)制的不斷出現(xiàn)和傳播，越來越多的細(xì)菌感染變得難以治療，有時甚至無法治療[7]?？股啬退幮哉趪?yán)重威脅著人類治療醫(yī)院和社區(qū)普通感染的能力，若無有效的抗感染治療，許多標(biāo)準(zhǔn)的治療方法均會失敗或變成高風(fēng)險程序；一旦全世界進(jìn)入后抗生素時代，普通感染和輕微損傷都將會再次造成死亡[8]。因此，研發(fā)新的抗感染策略和抗菌藥物已迫在眉睫。大量研究證實(shí)，陽離子卟啉光敏劑可有效殺滅體外培養(yǎng)的多種耐藥菌[9]，顯示出高效低毒的抗菌作用特點(diǎn)，但其抗菌作用機(jī)制尚不明確，推測與光動力療法（PDT）的抗腫瘤機(jī)制相似[10-11]，即光敏劑分子在激光照射下發(fā)生能級躍遷和能量轉(zhuǎn)移，釋放出大量活性氧物質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)菌微生物氧化失活。本研究的細(xì)菌活力檢測實(shí)驗(yàn)證實(shí)PACT的作用機(jī)理與光敏劑選擇性攻擊細(xì)菌表面的膜性結(jié)構(gòu)有關(guān)。

卟啉是4個吡咯環(huán)通過亞甲基相連形成的具有18個π電子的大環(huán)共軛體系，國內(nèi)外多項研究表明，卟啉類光敏劑對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有良好的抗菌活性[5,12-14]，特別是帶正電荷的陽離子卟啉光敏劑，由于微生物細(xì)胞膜內(nèi)正外負(fù)的特殊結(jié)構(gòu)，而具有更好的細(xì)菌選擇性。本研究介紹的CPD是通過賴氨酸對氨基四苯基卟啉進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾得到的陽離子卟啉光敏劑，從培養(yǎng)條件對CPD抑菌活性的影響、抑菌圈和體外PAE的測定3個實(shí)驗(yàn)可看出，帶正電荷的賴氨酸分子的引入，可明顯提高四苯基卟啉母核的光動力抗菌活性，同時由于修飾產(chǎn)物CPD的水溶性明顯提高，也為改善生物利用度和制劑研究提供了便利。

與傳統(tǒng)抗生素治療相比，PACT具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性和毒副作用低的優(yōu)勢，本研究結(jié)果亦證實(shí)陽離子卟啉光敏劑CPD具有高效的抗菌作用特點(diǎn)。目前有關(guān)PACT的研究主要集中于體外抗菌藥效學(xué)，也有部分研究將PACT應(yīng)用于口腔細(xì)菌感染和局部創(chuàng)傷感染的治療[15-16]。相信隨著新型光敏劑的開發(fā)和作用機(jī)制研究的深入，可預(yù)見將PACT應(yīng)用于臨床治療病原微生物感染一定會成為現(xiàn)實(shí)。

利益沖突 無

（圖1～3見插頁4-11）

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In vitro photodynamic antibacterial activity of cationic porphyrin derivative

Hong Ge,Ji Haiying,Pang Liyun,Su Zhe,Liu Tianjun

Insitute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Biomedical Materials,Tianjin 300192,China

Liu Tianjun,Email:liutianjun@hotmail.com

Objective To investigate susceptibility and antibacterial activity of cationic porphyrin derivative mediated photodynamic antimicrobial chemotherapy(CPD-PACT)against Pseudomonas aeruginosa,to provide experimental evidence for its high efficiency antibacterial activity.Methods The impacts of culture environments on minimum inhibitory concentration(MIC)were measured by double dilution method.The formation of inhibition zone was determined by diffusion plate method.The postantibiotic effect was analyzed by colony forming units.The viability and morphology of Pseudomonas aeruginosa were observed by confocal laser scanning microscopy (CLSM).Results The inoculum size of bacterial had a certain effect on the MIC.The MIC values increased as the pH of medium rose.When the calf serum content of culture medium increased,the MIC rose in light reaction and dropped in dark reaction.The diameter of inhibition zone mainly depended on the laser energy density,but not the concentration of photosensitizer.Though CPD possessed strong antimicrobial activity and persistent suppression on bacterial growth,the surviving Pseudomonas aeruginosa would soon continue to proliferate after PACT.The fluorescence images captured by CLSM showed that CPD-PACT could destroy the membrane integrity,leak the cytoplasmic component,decrease the bacterial activity and finally lead Pseudomonas aeruginosa to death. Conclusions CPD has strong inhibitory activity and obvious postantibiotic effect on Pseudomonas aeruginosa,which is suitable to be developed as an drug candidate for PACT.

Cationic porphyrin derivative; Pseudomonas aeruginosa; Photodynamic antimicrobial chemotherapy;Antibacterial activity

劉天軍，Email:liutianjun@hotmail.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．04．006

天津市科技支撐計劃項目（12ZCDZSY11900）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項（1517）；中國人民武裝警察部隊后勤學(xué)院災(zāi)害應(yīng)急救援醫(yī)學(xué)全軍重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（JY1405）

2016-04-29）