務(wù)圣潔 陳卓 胡春艷 秦玉 樊帆 王海 張琳華 陶偉 劉贛 曾小偉 梅林 朱敦皖300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（務(wù)圣潔、陳卓、胡春艷、秦玉、樊帆、王海、張琳華、朱敦皖）；518055深圳，清華大學(xué)深圳研究生院（陶偉、劉贛、曾小偉、梅林）

肝癌靶向載多烯紫杉醇聚多巴胺修飾琥珀酸酯-聚乳酸納米粒子的研究

務(wù)圣潔 陳卓 胡春艷 秦玉 樊帆 王海 張琳華 陶偉 劉贛 曾小偉 梅林 朱敦皖300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（務(wù)圣潔、陳卓、胡春艷、秦玉、樊帆、王海、張琳華、朱敦皖）；518055深圳，清華大學(xué)深圳研究生院（陶偉、劉贛、曾小偉、梅林）

目的 建立一種簡(jiǎn)便的、具有肝癌靶向的聚多巴胺表面修飾聚合物納米粒子以增加聚合物膜層和功能化的方法。方法 采用聚多巴胺修飾聚乙二醇1000-琥珀酸鹽-聚乳酸納米粒子（pD-TPGS-PLA/ NPs），并用其包載多烯紫杉醇（DTX）。為了達(dá)到靶向治療肝癌的作用，再將半乳糖胺連接在pD-TPGS-PLA/ NPs表面，從而通過配體-受體介導(dǎo)的作用提高DTX的遞送效率。結(jié)果 聚多巴胺-琥珀酸酯-聚乳酸納米粒子（pD-TPGS-PLA/NPs）和半乳糖胺-聚多巴胺-琥珀酸酯-聚乳酸納米粒子（Gal-pD-TPGS-PLA/NPs）在粒徑和形態(tài)學(xué)上與琥珀酸酯-聚乳酸納米粒子（TPGS-PLA/NPs）有明顯的不同。體外研究結(jié)果顯示，TPGS-PLA/ NPs、pD-TPGS-PLA/NPs和Gal-pD-TPGS-PLA/NPs對(duì)DTX有相似的釋放行為。激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞對(duì)于包載香豆素-6的Gal-pD-TPGS-PLA/NPs有較高地細(xì)胞攝取效率。相比于TPGS-PLA/NPs、pD-TPGS-PLA/NPs和臨床應(yīng)用的DTX藥物多西他賽，載DTX的Gal-pD-TPGS-PLA/NPs對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)有更強(qiáng)的抑制能力。體內(nèi)抗腫瘤研究結(jié)果顯示，在荷瘤裸鼠上注射包載DTX的Gal-pDTPGS-PLA/NPs能有效減小腫瘤尺寸。結(jié)論 Gal-pD-TPGS-PLA/NPs可通過配體-受體識(shí)別與肝癌細(xì)胞發(fā)生特有的相互作用，有望成為一種極具潛力的靶向治療肝癌的藥物遞送系統(tǒng)。

腫瘤納米技術(shù)； 多巴胺聚合； 表面修飾； 半乳糖化納米粒子； 肝靶向

Fund program:National Natural Science Foundation of China(81571793,51373199,81671806);Tianjin Natural Science Foundation(15JCZDJC38300);Basic Scientific Research Funds Programs in National Nonprofit Scientific Research Institutes(2016ZX310095,2016ZX310098)

0 引言

肝癌是世界上最流行的疾病之一，嚴(yán)重威脅人類的健康與生命。目前，癌癥的臨床治療手段主要是手術(shù)治療和化學(xué)療法。但是，大多數(shù)抗癌藥物存在副作用大和特異性差的缺點(diǎn)，從而影響了治療效果。聚合物納米粒子（nanoparticles,NPs）作為抗癌藥物載體可有效維持、控制和靶向藥物遞送，從而提高治療效果并減少對(duì)正常器官的毒副作用，使其近年來受到了越來越廣泛的關(guān)注[1]，如通過脂質(zhì)體遞送小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）治療肝癌的臨床試驗(yàn)已取得了良好的治療效果[2]。聚乳酸（polylactic acid,PLA）是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的生物可降解聚合物[3]，具有良好的生物安全性，在臨床上具有良好的應(yīng)用前景。琥珀酸酯（D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS）是天然維生素E的衍生物，在納米制劑中是一種優(yōu)良乳化劑。TPGS可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制P-糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥，提高抗癌藥物的口服生物利用度[4-5]。TPGS-PLA共聚物可有效提高藥物的包封率，促進(jìn)藥物釋放，加快細(xì)胞對(duì)載藥納米粒子的攝取[6]。聚合物納米粒子的制備工藝包括納米沉淀法、透析法、溶劑蒸發(fā)法和多重乳化法[7]。

藥物靶向遞送系統(tǒng)可將藥物靶向遞送至特定的組織或器官，在腫瘤臨床治療中有著突出的作用[8-9]。靶向配體有多種，如抗體、多肽、核酸和小分子。它們能促進(jìn)藥物通過胞吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞[10]。相比于化學(xué)療法，靶向藥物遞送能更有效地降低藥物毒副作用。肝癌細(xì)胞可通過表面的去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor,ASGPR）識(shí)別半乳糖和N-乙酰半乳糖胺終止的糖蛋白[11]。ASGPR介導(dǎo)的靶向治療被認(rèn)為是治療肝癌最有效的靶向藥物遞送系統(tǒng)之一[12-13]。

納米粒子經(jīng)配體修飾后可提高其與細(xì)胞的結(jié)合能力和細(xì)胞的攝取能力。然而，由于缺乏相應(yīng)的功能性基團(tuán)，納米粒子通常需要通過表面連接反應(yīng)基團(tuán)、偶聯(lián)劑和前體進(jìn)行活化[14-15]。在納米粒子表面修飾多巴胺聚合物可用來引入反應(yīng)化學(xué)基團(tuán)[16-17]，在弱堿性條件（pH 8～8.5）下，多巴胺鄰苯二酚被氧化成醌，并與相鄰的鄰苯二酚或醌相互作用形成聚多巴胺，最終在固體表面形成不溶于水的薄膜。功能性配體擁有親核的功能性基團(tuán)，如胺和硫醇，可通過Michael加成或Schiff堿反應(yīng)成為表面膜層的一部分[18-19]。

多烯紫杉醇（docetaxel,DTX）是治療實(shí)體瘤最常用的抗癌藥物之一[20-21]，可通過引起微管蛋白聚合和在G2-M期阻滯細(xì)胞分裂從而抑制細(xì)胞周期的有絲分裂[22]。筆者擬通過在載DTX的TPGS-PLA/NPs的表面引入聚多巴胺膜層，然后連接半乳糖胺靶向基團(tuán)，再對(duì)納米粒子的粒徑大小及分布、Zeta電位、表面形態(tài)學(xué)、藥物載藥量、包封率、藥物釋放行為、細(xì)胞攝取效率及其對(duì)HepG2細(xì)胞毒性等進(jìn)行研究，并對(duì)荷瘤裸鼠的抗肝癌腫瘤效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，考察聚多巴胺表面修飾納米粒子連接肝癌靶向配體實(shí)現(xiàn)肝癌靶向治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

4～5周齡雌性BALB/c裸鼠（體質(zhì)量15～20 g）（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所）。鹽酸多巴胺、鹽酸半乳糖胺、香豆素-6、噻唑藍(lán)（thiazoloyl blue tetrazolium bromide,MTT）（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），DTX（上海金河生物技術(shù)有限公司），反相C18液相色譜柱（150 mm×4.6 mm,5 μm）（美國(guó)Agilent技術(shù)公司），透析袋（截留分子質(zhì)量為3.5 ku）（上海生工生物技術(shù)有限公司）。人肝癌細(xì)胞系HepG2和人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2（美國(guó)ATCC）。

Nano-ZS90粒度分析儀（英國(guó)Malvern儀器有限公司），JSM-6700F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（fieldemission scanning elecctron microscope,FESEM）（日本JEOL公司），Tecnai G2 20透射電子顯微鏡（transmission eletron microscope,TEM）（美國(guó)FEI公司），LC1200高效液相色譜（美國(guó)Agilent技術(shù)公司），LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy,CLSM）（德國(guó)Carl Zeiss公司），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（flow cytometer,FCM）（美國(guó)BD公司），Thermo Varioskan Flash 3001酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 載DTX或香豆素-6的TPGS-PLA/NPs的制備

聚合物TPGS-PLA的合成參照前期發(fā)表論文所述方法[23]。將10 mg DTX和100 mg TPGS-PLA共聚物溶解于8 ml丙酮中；再用1 ml注射器取上述溶液在攪拌條件下逐滴加入至100 ml質(zhì)量濃度為0.3 g/L的TPGS水溶液中，室溫?cái)嚢柽^夜除去溶劑丙酮；隨后以20 000 r/min離心20 min收集納米粒子，并用10 ml去離子水洗滌3次除去乳化劑TPGS和未包載的藥物。載香豆素-6的納米粒子用相同的方法制備，香豆素-6的使用劑量為2 mg，其他條件相同。

1.2.2 pD-TPGS-PLA/NPs的制備

將TPGS-PLA/NPs加入到質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml的鹽酸多巴胺溶液（溶劑為10 mmol/L氨丁三醇緩沖液，pH 8.5）中，室溫?cái)嚢璺跤? h即得pD-TPGSPLA/NPs。

1.2.3 Gal-pD-TPGS-PLA/NPs的制備

功能性配體半乳糖胺通過Michael加成反應(yīng)連接到pD-TPGS-PLA/NPs的表面[16]。將pD-TPGS-PLA/ NPs用含半乳糖胺的氨丁三醇緩沖液（10 mmol/L，pH 8.5）重懸，室溫?cái)嚢? h，離心，去離子水洗滌3次，最后凍干即得Gal-pD-TPGS-PLA/NPs。通過多巴胺聚合物和半乳糖胺對(duì)納米粒子進(jìn)行表面修飾的示意圖如圖1所示。

1.2.4 粒徑和Zeta電位

納米粒子（約2 mg）在測(cè)量前用去離子水重懸并超聲。載DTX的TPGS-PLA/NPs、pD-TPGS-PLA/ NPs和Gal-pD-TPGS-PLA/NPs的平均粒徑、粒徑分布、Zeta電位均通過粒度分析儀測(cè)量。數(shù)據(jù)均為3次測(cè)量的平均值。

1.2.5 表面形態(tài)觀察

納米粒子的表面形態(tài)是通過FESEM在3.0 kV的加速電壓下使用JEOL JSM-6700F系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)使用TEM來研究納米粒子的形態(tài)。

1.2.6 載藥量和包封率的測(cè)定

載DTX納米粒子的載藥量和包封率通過高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)量。將5 mg納米粒子溶于1 ml二氯甲烷中，渦旋；隨后轉(zhuǎn)入5 ml流動(dòng)相（乙腈和去離子水體積比為50∶50）中，氮吹15 min除去二氯甲烷，用于液相分析。使用反相C18液相色譜柱，流動(dòng)相流速設(shè)為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm。每批樣品測(cè)量3次。藥物載藥量和包封率的計(jì)算公式如下

1.2.7 體外藥物釋放

精確稱量?jī)龈傻募{米粒子5 mg，分散到1 ml釋放介質(zhì)（pH 7.4，含質(zhì)量濃度為1 g/L吐溫80的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS））中形成懸液。吐溫80用于增大DTX在緩沖液中的溶解度并防止DTX結(jié)合到管壁上。隨后，懸液轉(zhuǎn)入透析袋（截留分子質(zhì)量為3.5 ku）并浸入含15 ml PBS釋放液的離心管中，保持37℃、200 r/min震蕩離心管。每天更換透析袋外面的釋放緩沖液，并利用高效液相色譜法進(jìn)行分析。14 d后繪制載DTX納米粒子與時(shí)間相關(guān)的累積釋放曲線。

1.2.8 細(xì)胞攝取

HepG2細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在腔室蓋玻片上于5%CO2、37℃的環(huán)境下培養(yǎng)。采用載香豆素-6的納米粒子觀測(cè)和分析細(xì)胞攝取。將HepG2細(xì)胞與質(zhì)量濃度為25 μg/ml載香豆素-6的納米粒子37℃孵育1 h或2 h后，冷PBS沖洗3次；再用冷甲醇固定20 min；用DAPI復(fù)染細(xì)胞核10 min，PBS洗3次除去游離DAPI。使用CLSM分別在激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm和485 nm的通道進(jìn)行觀察。

在FCM分析過程中，先將HepG2細(xì)胞分別與質(zhì)量濃度均為100 μg/ml載香豆素-6的TPGS-PLA/ NPs、pD-TPGS-PLA/NPs和Gal-pD-TPGS-PLA/NPs在37℃共同孵育1 h，然后用PBS洗滌和收集細(xì)胞，再通過FCM在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)檢測(cè)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光物質(zhì)香豆素-6。對(duì)10 000個(gè)細(xì)胞在530 nm發(fā)射波長(zhǎng)的熒光信號(hào)進(jìn)行收集、放大和擴(kuò)展形成單參數(shù)的直方圖。

進(jìn)行定量分析時(shí)，將HepG2細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種至96孔板中孵育過夜；用平衡鹽溶液（HBSS）37℃平衡1 h后，分別與質(zhì)量濃度為50、100和500 μg/ml載香豆素-6的納米粒子孵育2 h；吸棄溶液，用冷PBS洗滌3次；每孔加入50 μl含0.2 mol/L NaOH的0.5%Triton X-100溶液裂解細(xì)胞；最后用酶標(biāo)儀分別于激發(fā)波長(zhǎng)為430 nm和485 nm處檢測(cè)熒光強(qiáng)度。細(xì)胞攝取效率表示為細(xì)胞相關(guān)熒光與加入熒光溶液熒光的百分比。

1.2.9 細(xì)胞存活率

將HepG2細(xì)胞以1×104個(gè)/孔鋪于96孔板中，孵育過夜；分別與未載藥及載DTX的TPGS-PLA/ NPs、pD-TPGS-PLA/NPs、Gal-pD-TPGS-PLA/NPs懸液（DTX的質(zhì)量濃度為0.25、2.50、12.50、25.00 μg/ml）孵育24 h和48 h；吸棄懸液，加入含MTT（質(zhì)量濃度為5 mg/ml）的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4 h；吸棄MTT并加入二甲基亞砜溶解甲臜晶體，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm處測(cè)量吸光度值。未被處理細(xì)胞的存活率視為100%并作為對(duì)照[24]。將各組樣品的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration,IC50）與對(duì)照樣品進(jìn)行比較。

1.2.10 動(dòng)物腫瘤模型的建立

將約0.1 ml溶解在PBS中的HepG2細(xì)胞植入BALB/c裸鼠的右側(cè)皮下，劑量為2×106個(gè)細(xì)胞/裸鼠。接種后，密切觀察每只老鼠的狀態(tài)和腫瘤生長(zhǎng)情況。腫瘤體積計(jì)算公式如下

1.2.11 體內(nèi)治療效果研究

當(dāng)腫瘤體積達(dá)到50 mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為5組，分別于0、4、8、12 d進(jìn)行注射給藥。其中1組腹腔注射生理鹽水設(shè)為對(duì)照組；另外4組分別注射DTX劑量為10 mg/kg的TPGS-PLA/NPs、pD-TPGSPLA/NPs、Gal-pD-TPGS-PLA/NPs和多西他賽注射液。密切觀察裸鼠的臨床癥狀和行為，每2天通過游標(biāo)卡尺對(duì)腫瘤體積進(jìn)行測(cè)量。裸鼠在接受治療的第14天后脫頸處死，并測(cè)量腫瘤最終質(zhì)量用來評(píng)估載藥納米粒的抗腫瘤活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米粒子的表征

TPGS-PLA/NPs、pD-TPGS-PLA/NPs和Gal-pDTPGS-PLA/NPs的粒徑大小及其分布通過動(dòng)態(tài)光反射獲得（表1）。pD-TPGS-PLA/NPs和Gal-pD-TPGSPLA/NPs由于包裹了聚多巴胺膜層，其粒徑明顯大于TPGS-PLA/NPs。TPGS-PLA/NPs的Zeta電位為（-16.4±3.7）mV，負(fù)電荷可能是由PLA表面的羧酸鹽引起的；表面引入聚多巴胺膜層后Zeta電位依然為負(fù)，可能是聚多巴胺膜層在中性pH下酚羥基去離子化后形成負(fù)電荷引起的[25]。Gal-pD-TPGS-PLA/ NPs和pD-TPGS-PLA/NPs的Zeta電位無明顯差別，說明連接在pD-TPGS-PLA/NPs的半乳糖胺不是很穩(wěn)定，這與Park等[16]的研究結(jié)果類似。Gal-pDTPGS-PLA/NPs的載藥量和包封率較TPGS-PLA/ NPs和pD-TPGS-PLA/NPs略低，可能是在連接半乳糖胺的過程中損失了一部分DTX。

在FESEM圖中，并未發(fā)現(xiàn)TPGS-PLA/NPs、pDTPGS-PLA/NPs和Gal-pD-TPGS-PLA/NPs 3者形態(tài)有明顯區(qū)別（圖2A）；而在TEM圖中，可明顯看到引入聚多巴胺和半乳糖胺后在TPGS-PLA/NPs外層多了一個(gè)膜層，尺寸也明顯加大（圖2B）。證明在TPGS-PLA/NPs外層引入聚多巴胺是成功的，此結(jié)果與Wang等[26]的研究結(jié)果一致。

2.2 體外藥物釋放

載DTX的TPGS-PLA/NPs、pD-TPGS-PLA/NPs和Gal-pD-TPGS-PLA/NPs在體外釋放14 d的結(jié)果如圖3所示。在初始階段，所有納米粒子均存在突釋行為，釋放第2天載入的DTX已釋放30%；14 d后，載DTX的TPGS-PLA/NPs、pD-TPGS-PLA/NPs和Gal-pD-TPGS-PLA/NPs分別釋放了55.07%、54.33%和53.86%。說明這3種納米粒子對(duì)DTX有著相同的釋放行為，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 納米粒子的細(xì)胞攝取

表1 載多烯紫杉醇納米粒子的表征（±s）

表1 載多烯紫杉醇納米粒子的表征（±s）

樣品 粒徑（nm） 多分散系數(shù) Zeta電位（mV） 載藥量（%） 包封率（%）TPGS-PLA/NPs 126.5±7.2 0.142 -16.4±3.7 8.23±0.14 89.68±1.56 pD-TPGS-PLA/NPs 205.2±8.3 0.137 -14.5±2.5 8.07±0.21 89.25±2.37 Gal-pD-TPGS-PLA/NPs 209.4±5.1 0.145 -13.7±2.1 7.69±0.19 88.47±1.95

為檢測(cè)HepG2細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取，將DTX用香豆素-6替代并用CLSM檢測(cè)。圖4A顯示了HepG2細(xì)胞分別與質(zhì)量濃度為25 μg/ml載香豆素-6的納米粒子共同孵育1 h和2 h后的CLSM圖?？梢钥闯?，孵育1 h后，Gal-pD-TPGS-PLA/NPs組熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于TPGS-PLA/NPs和pD-TPGSPLA/NPs組，說明Gal-pD-TPGS-PLA/NPs表面的半乳糖胺對(duì)于靶向遞送藥物至關(guān)重要。為了進(jìn)一步研究Gal-pD-TPGS-PLA/NPs中半乳糖胺在細(xì)胞攝取過程中的作用，將半乳糖胺和Gal-pD-TPGS-PLA/ NPs同時(shí)加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，熒光發(fā)生淬滅。用人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2作為對(duì)照，與Gal-pD-TPGS-PLA/NPs孵育1 h后，CNE-2細(xì)胞中幾乎無熒光。此外，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，各實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度均有所增強(qiáng)，說明半乳糖胺修飾的納米粒子與HepG2細(xì)胞是通過配體-受體識(shí)別相互作用的。

由圖4B可知，將HepG2細(xì)胞分別與質(zhì)量濃度為50、100、500μg/ml載香豆素-6的TPGS-PLA/NPs、pDTPGS-PLA/NPs和Gal-pD-TPGS-PLA/NPs孵育2 h，隨著質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞攝取效率逐漸降低；但對(duì)Gal-pD-TPGS-PLA/NPs的攝取仍高于 TPGS-PLA/ NPs和pD-TPGS-PLA/NPs。

FCM檢測(cè)細(xì)胞攝取的結(jié)果見圖4C，與Gal-pDTPGS-PLA/NPs孵育的HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng)于與TPGS-PLA/NPs和pD-TPGS-PLA/NPs孵育的細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

2.4 納米粒子對(duì)細(xì)胞存活率的影響

孵育24 h和48 h細(xì)胞存活率結(jié)果如圖5所示。與載DTX的TPGS-PLA/NPs和pD-TPGS-PLA/NPs相比，載DTX的Gal-pD-TPGS-PLA/NPs對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)有更強(qiáng)的抑制作用，未載藥納米粒子對(duì)細(xì)胞則無明顯毒性，表明制備的納米粒子具有良好的生物相容性，且對(duì)組織和細(xì)胞無毒性。

IC50是指引起50%細(xì)胞死亡時(shí)的藥物濃度，各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。共同孵育24 h后，多西他賽與載 DTX的 TPGS-PLA/NPs和 pD-TPGS-PLA/ NPs的IC50相近，Gal-pD-TPGS-PLA/NPs組則明顯較低；孵育48 h后，3種納米粒子的IC50明顯低于多西他賽，且Gal-pD-TPGS-PLA/NPs組仍為最低。體外實(shí)驗(yàn)表明，納米粒子包載的DTX對(duì)HepG2細(xì)胞有更好的治療效果，且Gal-pD-TPGS-PLA/NPs較未修飾的納米粒子對(duì)肝癌有更好的靶向作用。

表2 多西他賽與載多烯紫杉醇納米粒子共同孵育24 h或48 h后的IC50值（±s，μg/ml）

表2 多西他賽與載多烯紫杉醇納米粒子共同孵育24 h或48 h后的IC50值（±s，μg/ml）

注：IC50—半抑制濃度

樣品 孵育24 h 孵育48 h多西他賽 25.25±1.23 12.26±0.82 TPGS-PLA/NPs 25.66±1.54 3.29±0.56 pD-TPGS-PLA/NPs 23.34±1.47 3.47±0.78 Gal-pD-TPGS-PLA/NPs 10.19±0.92 0.56±0.06

2.5 體內(nèi)抗腫瘤效果

與生理鹽水組相比，載DTX的納米粒子和多西他賽均能很好地抑制腫瘤的生長(zhǎng)。其中，Gal-pDTPGS-PLA/NPs組腫瘤的生長(zhǎng)速度最慢，這與體外細(xì)胞毒性結(jié)果一致（圖6A）。所有裸鼠在給藥后體質(zhì)量均有所降低，但在4 d后有所回升（圖6B）。離體腫瘤圖像和質(zhì)量測(cè)量結(jié)果顯示，Gal-pD-TPGSPLA/NPs對(duì)荷瘤BALB/c裸鼠具有更強(qiáng)的腫瘤抑制作用。

3 結(jié)論

本研究成功制備了經(jīng)聚多巴胺修飾并連接半乳糖胺的Gal-pD-TPGS-PLA/NPs，并對(duì)納米粒子的粒徑、形態(tài)及包載DTX行為進(jìn)行了表征，Gal-pD-TPGSPLA/NPs的粒徑約為200 nm。體外細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gal-pD-TPGS-PLA/NPs通過受體-配體識(shí)別靶向作用于肝癌細(xì)胞并對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，載DTX的Gal-pD-TPGS-PLA/NPs比多西他賽、生理鹽水、載DTX的TPGS-PLA/NPs和pD-TPGS-PLA/NPs均有較強(qiáng)的腫瘤抑制作用。Gal-pD-TPGS-PLA/NPs有望作為靶向治療肝癌或肝臟其他疾病的藥物遞送系統(tǒng)。

利益沖突 無

（圖1～6見插頁(yè)4-2～4-4）

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Docetaxel-loaded polydopamine-modified TPGS-PLA nanoparticles as a liver cancer targeted drug deliverysystem

Wu Shengjie,Chen Zhuo,Hu Chunyan,Qin Yu,Fan Fan,Wang Hai,Zhang Linhua,Tao Wei,Liu Gan, Zeng Xiaowei,Mei Lin,Zhu Dunwan
Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Biomedical Materials,Tianjin 300192,China(Wu SJ,Chen Z,Hu CY,Qin Y,Fan F,Wang H, Zhang LH,Zhu DW)；Division of Life and Health Sciences,Graduate School at Shenzhen,Tsinghua University, Shenzhen 518055,China(Tao W,Liu G,Zeng XW,Mei L)

Zhu Dunwan,Email:zhudunwan@163.com

Objective To develop a simple way to functionalize polymeric nanoparticle(NP)surfaces with ligands and/or additional polymeric layers with polydopamine-based surface modification.Methods The docetaxel (DTX)-loaded formulations was developed using polydopamine-modified NPs synthesized using D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate-poly(lactide)(pD-TPGS-PLA/NPs).To target liver cancer cells,galactosamine was conjugated on the prepared pD-TPGS-PLA/NPs to enhance the delivery of DTX via ligand-mediated endocytosis. Results The size and morphology of pD-TPGS-PLA/NPs and Gal-pD-TPGS-PLA/NPs changed obviously compared with TPGS-PLA/NPs.In vitro studies showed that TPGS-PLA/NPs,pD-TPGS-PLA/NPs and Gal-pD-TPGS-PLA/NPs had similar release profiles of DTX.Both confocal laser scanning microscopy and flow cytometric results showed that coumarin 6-loaded Gal-pD-TPGS-PLA/NPs had the highest cellular uptake efficiency in liver cancer cell line HepG2. Moreover,DTX-loaded Gal-pD-TPGS-PLA/NPs inhibited the growth of HepG2 cells more potently than TPGS-PLA/ NPs,pD-TPGS-PLA/NPs,and a clinically available DTX formulation(Taxotere).The in vivo anti-tumor effects study showed that injecting DTX-loaded Gal-pD-TPGS-PLA/NPs reduced the tumor size most significantly on hepatomabearing nude mice.Conclusions These results suggest that Gal-pD-TPGS-PLA/NPs prepared in the studyspecifically interacted with the hepatocellular carcinoma cells through ligand-receptor recognition and they may be used as a potentially eligible drug delivery system targeting liver cancers.

Cancer nanotechnology; Dopamine polymerization; Surface modification;Galactosylated nanoparticles;Liver targeting

朱敦皖，Email:zhudunwan@163.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．04．001

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81571793,51373199，81671806）；天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（15JCZDJC38300）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2016ZX310095，2016ZX310098）

2016-06-17）