許國軍 朱咸兵 李勃 朱朋飛 王榮

518055深圳，清華大學(xué)深圳研究生院（許國軍、朱咸兵、李勃）；100084北京，清華大學(xué)材料學(xué)院（許國軍、李勃），生命科學(xué)學(xué)院（朱咸兵）；110016沈陽，中國科學(xué)院金屬研究所（朱朋飛、王榮）

3D打印β-TCP/HA/PLA骨移植支架材料的研究

許國軍 朱咸兵 李勃 朱朋飛 王榮

518055深圳，清華大學(xué)深圳研究生院（許國軍、朱咸兵、李勃）；100084北京，清華大學(xué)材料學(xué)院（許國軍、李勃），生命科學(xué)學(xué)院（朱咸兵）；110016沈陽，中國科學(xué)院金屬研究所（朱朋飛、王榮）

目的 制備個性化的3D打印骨移植支架修復(fù)材料，以滿足骨缺損患者的需求。方法 運用計算機軟件CAD設(shè)計出三維木堆結(jié)構(gòu)的模型圖，通過三維氣浮運動平臺，使用3D打印方法模擬出三維木堆結(jié)構(gòu)的復(fù)合β-磷酸三鈣（β-TCP）、羥基磷灰石（HA）和聚乳酸（PLA）材料的支架。再對支架材料進行抽真空熱處理，X射線能譜儀檢測其氯仿殘留量，掃描電鏡觀察支架材料的表面形貌，最后用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測支架材料對人SV40轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞hFOB1.19的毒性。結(jié)果 當(dāng)打印漿料的擠出氣壓在137.9～413.7 kPa內(nèi)，可打印出β-TCP/HA/PLA三維骨移植支架材料。成型后的三維骨移植支架材料經(jīng)90℃保溫抽真空處理及150℃熱處理后能消除其中的氯仿；材料表面粗糙，擁有表面細(xì)孔和內(nèi)部連通的微孔；其同hFOB1.19細(xì)胞共培養(yǎng)7 d，細(xì)胞毒性等級為0級。結(jié)論 本研究制備的3D打印β-TCP/HA/PLA骨移植支架材料表面粗糙而具有通孔，利于成骨細(xì)胞的培養(yǎng)，且骨誘導(dǎo)作用明顯，體現(xiàn)出3D打印在制備骨移植多孔材料上擁有很大的優(yōu)勢和發(fā)展前景。

3D打?。?木堆結(jié)構(gòu)； 骨移植； 多孔材料

Fund program:Special Funds of Strategic Emerging Industries in Shenzhen(CXZZ20130322164541915)

0 引 言

據(jù)統(tǒng)計，每年我國約有300萬例的骨缺損病例，主要是由于交通安全事故導(dǎo)致的骨創(chuàng)傷性骨折、骨腫瘤及股骨頭壞死等骨科疾病引起。在臨床上骨缺損通常采用骨移植的方式進行修復(fù)填補和骨愈合。目前，應(yīng)用于臨床的骨移植材料主要包含以下3種：自體骨[1]、異體骨[2-3]和人造組織工程骨[4]材料。其中，自體骨與患者擁有最好的結(jié)合性，還擁有骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性且在移植體內(nèi)能夠成骨，所以人們常把自體骨移植作為骨移植的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，由于所取的骨量非常有限，往往不能滿足患者的要求，尤其是對于大面積創(chuàng)傷的患者，取骨量成為其最大的限制因素，導(dǎo)致患者不能選用自體骨作為康復(fù)治療骨疾病的材料。在歐美國家，因其具有完備的骨組織庫和相關(guān)的法律體系保護措施，異體骨成為骨移植最常用的替代材料之一。但異體骨在植入人體后骨傳導(dǎo)性較差，需要根據(jù)植骨移植以后的固定情況來決定是否加固金屬。人造組織工程骨是骨移植材料的另一個重要來源，包含金屬支架材料、生物陶瓷材料、聚合物支架材料[5]及復(fù)合材料等。3D打印骨支架技術(shù)[6]的興起，使得人造組織工程骨越來越受到人們的青睞，為此，筆者擬研究復(fù)合β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate,β-TCP）、羥基磷灰石（hydroxyapatite,HA）和少量聚乳酸（polylactic acid, PLA）材料，制備性能優(yōu)異的生物陶瓷骨修復(fù)材料[7]，并通過3D打印快速成型設(shè)備將骨修復(fù)漿料打印出三維多孔支架[8]材料。此外，還可根據(jù)病人個性化的預(yù)定要求，制出任意復(fù)雜形狀的多孔高活性骨修復(fù)材料。本研究將進一步改進傳統(tǒng)骨修復(fù)材料存在的不足，推動高活性骨修復(fù)材料開發(fā)和快速成型技術(shù)的應(yīng)用，為臨床應(yīng)用提供產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

PLA（黏度η=0.84dl/g，數(shù)均分子質(zhì)量為1×105u）（山東省醫(yī)療器械研究所），氫氧化鈣（Ca（OH）2，ACS，純度≥95.0%）、磷酸（H3PO4，ACS，純度≥85%）、HA（Ca5（PO4）3（OH），純度≥97%，粒度＜100 nm）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），氯仿（CHCl3，分析純，相對分子質(zhì)量為119.38 u）（衡陽凱信化工試劑有限公司）。

FG100三維氣浮運動平臺（美國Aerotech公司），氣體控制點膠設(shè)備（易孚迪感應(yīng)設(shè)備（上海）有限公司），Mastersizer 2000型激光粒度儀（英國Malvern儀器有限公司），Rigaku D/max 2500 PC X射線衍射儀 (日本理學(xué)株式會社)，S-4800型場發(fā)射電子掃描顯微鏡（日本日立公司），Oxford X-Max 20電致冷X射線能譜儀（英國牛津儀器公司），Tecan Freedom Evolyzer-2200酶聯(lián)免疫檢測儀（瑞士Tecan公司）。

1.2 方法

1.2.1 β-TCP的制備

采用水系合成法制備β-TCP，具體過程如圖1所示。將購得的氫氧化鈣和磷酸按一定的鈣磷比即Ca/P=1.5，先加入磷酸，后加入氫氧化鈣，混合于燒杯中，在恒溫水浴鍋中反應(yīng)，反應(yīng)式如下

然后抽濾，將得到的沉淀物置于潔凈的球磨罐中，用氧化鋯球球磨24 h，得到細(xì)粉；將粉末置于真空烘箱中干燥，90℃烘干2 h，得β-TCP的前驅(qū)體；再于850℃高溫焙燒3 h，隨爐空冷冷卻后即得β-TCP。

圖1 β-磷酸三鈣的制備過程

1.2.2 3D打印漿料的制備

3D打印漿料的流變特性對于打印成型的三維支架材料的性能影響極大，為了研究HA[9]、β-TCP[10]和PLA[11]混合漿料的流變力學(xué)特性，共進行了6組實驗。先以氯仿為溶劑配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的不同含量β-TCP和HA的溶液，再分批加入PLA，配制出不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的漿料。表1為漿料中的氯仿除去后即3D打印支架材料中各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。漿料配好后，裝填入打印的針管中，靜置陳化24 h。

表1 3D打印支架材料中各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3D打印的生物陶瓷材料可由公式（2）來表征其流變特性

式中：y是所采用漿料的流變特性參數(shù)（一般指彈性模量和臨界剪切應(yīng)力等），x是常數(shù)指數(shù)（取2.5左右），φgel是凝膠臨界點對應(yīng)的固含量，φ是所配制漿料的固含量，k是常數(shù)。由公式（2）可知，一般情況下，彈性模量只由φ和φgel決定。

研究表明，在3D打印過程中，對針管施加氣壓壓力作用于漿料上時，漿料呈現(xiàn)一定的黏性，使?jié){料更易被擠出，流動性更好；擠出后，所產(chǎn)生的氣壓消失，這時漿料往往有一定的收縮彈性，陶瓷漿料會發(fā)生收縮，以便成型。

1.2.3 3D打印模型的建立

3D打印之前，必須要進行三維建模處理。三維模型的建立，可使所構(gòu)建的三維支架材料更簡便直觀，且更易根據(jù)打印平臺的實際尺寸來構(gòu)建三維模型[12]。

本研究使用AutoCAD 2007[13]來構(gòu)建三維木堆結(jié)構(gòu)模型，三維木堆結(jié)構(gòu)因結(jié)構(gòu)簡單且圖形代碼易于編寫，被廣泛用于科研研究。在圖形建模完成以后，將所得的模型代碼導(dǎo)出，得到可以編輯的代碼，后者即能被機器識別。

本研究采用的FG100三維氣浮運動平臺，其運動精度為400 nm，定位精度為2～4 nm，可高精度地打印所設(shè)計的模型結(jié)構(gòu)。采用的氣體控制點膠設(shè)備可通過控制氣體壓力來控制擠出壓力，調(diào)整好3D打印成型設(shè)備以后，調(diào)整擠出氣體的氣壓值為137.9～413.7 kPa，所選用的針頭內(nèi)徑為60～1 550 μm。

1.2.4 三維支架材料的脫離

陶瓷漿料在擠出成型的過程中，因有機溶劑揮發(fā)量的不同，邊界與中間成型以后收縮量也不相同，邊界收縮較快，收縮量也越大，往往會出現(xiàn)邊界曲翹的現(xiàn)象，收縮量變化如圖2所示。

依據(jù)上述的支架材料收縮特性，需要在材料成型以后進行支架與支撐玻璃片的脫離處理，且不能破壞支架的結(jié)構(gòu)。

1.2.5 抽真空熱處理

在支架材料與玻璃片脫離后，三維支架材料中仍含有一定量的有機溶劑氯仿。因生物學(xué)實驗的要求比較嚴(yán)格，生物材料中不能有有機氯的殘留；有機氯的殘留會導(dǎo)致小鼠死亡，其半數(shù)致死量為1 194 mg/kg，故在后續(xù)實驗中要脫去殘留的氯仿。其抽真空熱處理的過程如圖3所示。將制得的三維支架材料在90℃的條件下干燥3 h，再于150℃預(yù)燒9 h。由于氯仿的沸點為61～62℃，故通過加熱至90℃抽真空和150℃預(yù)燒可排出絕大部分的氯仿。

圖3 三維支架材料的真空熱處理過程

1.2.6 粒度分析

采用激光粒度儀分別對HA和β-TCP進行粒度分析，以便于對3D打印粉末材料的要求進行評估。

1.2.7 X射線衍射分析

采用X射線洐射儀對制得的β-TCP粉末進行檢測。衍射儀采用Cu靶材作為X射線源，管電壓為40 kV，管電流為200 mA，衍射角的掃描范圍為5°～70°，掃描速度為5°/min。

1.2.8 掃描電鏡觀察

將制得的β-TCP粉末用水分散，取分散液滴于硅片上，干燥后噴金15 s，采用掃描電鏡進行表面形貌分析。同樣，對成型的β-TCP/HA/PLA三維支架表面進行噴金處理，再進行表面形貌分析。

1.2.9 X射線能譜分析

采用電致冷X射線能譜儀檢測成型的β-TCP/ HA/PLA三維支架材料中的氯元素含量，通過定性和定量分析來確定材料中氯仿的殘留量，從而進一步判斷打印的三維支架材料的生物學(xué)性能。

1.2.10 細(xì)胞毒性測試

將人SV40轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞hFOB1.19按5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，實驗組分別加入不同成分的β-TCP/HA/PLA三維支架材料共培養(yǎng)7 d，同時設(shè)置對照組（不加三維支架材料）；吸棄培養(yǎng)液，每孔加入20 μl質(zhì)量濃度為5 mg/ml的噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；最后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm處各孔的吸光度（OD）值并進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用獨立樣本t檢驗比較同一時間點OD值的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 陶瓷粉末及打印漿料的表征

由水系合成法制備的無定形態(tài)的磷酸鈣經(jīng)850℃高溫?zé)Y(jié)處理后得β-TCP，其表面形貌及物相分析如圖4所示。由圖4A可知，制得的β-TCP顆粒近球形，尺寸為1～3 μm，均勻細(xì)小，燒結(jié)效果較好。整體分布較均勻，出現(xiàn)了部分團聚的現(xiàn)象，分析其原因，可能是在燒結(jié)過程中采用了隨爐冷卻的方法，出現(xiàn)了二次結(jié)晶的現(xiàn)象。由圖4B可看出，制得的β-TCP的主要特征峰對應(yīng)于X射線衍射標(biāo)準(zhǔn)卡片，物相較純。

粒度分析結(jié)果表明，β-TCP和HA的粒度范圍相近，均滿足打印所用針頭的要求。（圖5）

按表1中各成分的配比，采用氯仿作為溶劑，得到不同成分的漿料，并對漿料進行流變分析。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的PLA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的β-TCP為例，其流變分析結(jié)果如圖6所示。G'代表膠體漿料的儲能模量[14]，G''代表膠體漿料的損耗模量。當(dāng)達(dá)到G'＜G''時，漿料呈一定的黏性，才更易從針頭中擠出；擠出過程完成后漿料發(fā)生回復(fù)，G'＞G''，且穩(wěn)定在105Pa，漿料呈現(xiàn)一定的彈性性能，這樣有利于陶瓷漿料的成型，并促進三維木堆結(jié)構(gòu)的自支撐作用，使其不會因重力作用而塌陷，滿足漿料的設(shè)計要求。

此外，當(dāng)固含量提高時，漿料成型變快，但其干燥的速度也加快，往往會因為干燥過快而堵塞針頭。所以，選擇合適的打印漿料成分至關(guān)重要。陳化過程中，陶瓷漿料的流動性會顯著提高，打印過程中的流動性亦會更好。

2.2 三維支架材料的表面分析

經(jīng)90℃保溫抽真空和150℃熱處理后的β-TCP/HA/PLA三維支架材料，其表面能譜分析結(jié)果如表2所示；掃描電鏡觀察到其表面顆粒較為清晰，表面粗糙度較高，同時擁有表面細(xì)孔和內(nèi)部連通的微孔（圖7）。由于三維木堆結(jié)構(gòu)的表面粗糙度高，在模擬體液（simulated body fluid,SBF）中與細(xì)胞共培養(yǎng)時，可增強細(xì)胞對支架材料的黏附作用，使得細(xì)胞能貼在材料表面生長，為之后的細(xì)胞培養(yǎng)提供了依據(jù)。表面細(xì)孔和內(nèi)部連通的微孔則提供了細(xì)胞生長所需營養(yǎng)的流動通道，利于培養(yǎng)基的流動，從而促使細(xì)胞在貼壁生長完成后能持續(xù)增殖和分化。

表2 三維木堆支架結(jié)構(gòu)的X射線電子能譜分析

2.3 三維支架材料的細(xì)胞毒性分析

圖8為不同成分的β-TCP/HA/PLA三維支架材料對人SV40轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞hFOB1.19的細(xì)胞毒性[15-16]結(jié)果，其中1～6號樣品的成分見表1，7號為對照組?？梢钥闯?，hFOB1.19細(xì)胞與1～6號樣品培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞存活率[17]分別為0.767±0.045、0.757± 0.036、0.710±0.051、0.681±0.013、0.667±0.077和0.630±0.032，與對照組（0.583±0.042）比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由此可判斷，本研究制得的6種不同成分的β-TCP/HA/PLA三維支架材料的細(xì)胞毒性等級均為0級，可滿足臨床植入實驗的要求。

圖8 不同成分的β-TCP/HA/PLA三維支架材料與hFOB1.19細(xì)胞共培養(yǎng)7 d的細(xì)胞毒性結(jié)果

3 結(jié)論

本研究選取的粉末狀3D打印材料的粒徑為1～100 μm，在針頭的可控范圍內(nèi)，以便在針筒中能順利擠出成型。當(dāng)所配漿料的剪切力較小時，G'＞G''，擠出之前漿料呈黏性，擠出方便；剪切力較大時，G''＞G'，擠出以后漿料伴隨著細(xì)化，呈彈性可起到自支撐，有利于成型。打印成型后的三維骨移植支架材料經(jīng)90℃保溫抽真空處理及150℃熱處理后，可消除其中的有機溶劑氯仿，從而降低殘留的有機溶劑對細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞毒性的影響。細(xì)胞毒性結(jié)果表明，采用3D打印直寫成型技術(shù)制備的不同成分的β-TCP/HA/PLA三維骨移植支架材料的細(xì)胞毒性均為0級，毒性較小符合移植[18]的條件。

利益沖突 無

（圖2、4～6見插頁4-10，圖7見插頁4-13）

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Research on 3D printed β-TCP/HA/PLA scaffolds for bone grafts

Xu Guojun,Zhu Xianbing,Li Bo,Zhu Pengfei,Wang Rong

Graduate School at Shenzhen,Tsinghua University,Shenzhen 518055,China(Xu GJ,Zhu XB,Li B);School of Materials Science and Engineering,Tsinghua University,Beijing 100084,China(Xu GJ,Li B),Division of Life and Health Sciences(Zhu XB);Institute of Metal Research,Chinese Academy of Sciences,Shenyang 110016,China (Zhu PF,Wang R)

Li Bo,Email:boli@mail.tsinghua.edu.cn

Objective To develop the personalized 3D printing scaffolds for bone grafts,to meet the needs of the patients with the bone defect.Methods The model of three-dimensional woodpile structure was designed by the software of computer-aided design(CAD).The β-tricalcium phosphate(β-TCP),hydroxyapatite(HA),and polylactic acid(PLA)composite scaffolds with three-dimensional woodpile structure was simulated using 3D printing method by three-dimensional air floating platform.The three-dimensional bone graft scaffolds was then vacuum heattreated,and the residual chloroform was detected by energy dispersive X-ray spectrometer.The morphology of the β-TCP/HA/PLA scaffolds was characterized by scanning electron microscope,and in vitro cytotoxicity against osteoblasts hFOB1.19 was assessed by thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT)assay.Results When the extrusion pressure of printing slurry was 137.9-413.7 kPa,the three-dimensional bone graft scaffolds could be printed out. Then the scaffolds was vacuum treated at 90℃and preheated at 150℃,which could eliminate the solvent CHCl3. The three-dimensional bone graft scaffolds,with a through-hole and rough surface,was co-cultured with osteoblasts hFOB1.19 for 7 d,and it's cytotoxicity grade was grade 0.Conclusions The three-dimensional bone graft scaffolds have a through-hole and rough surface,which is favorable to the osteoblasts culture and bone induction,indicating the advantage and development prospects of 3D printing in the preparation of porous materials for bone grafts.

3D printing;Woodpile structure;Bone grafts; Porous material

李勃，Email:boli@mail.tsinghua.edu.cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．04．005

深圳市戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)專項資金（CXZZ20130322164541915）

2016-05-20）