趙　丹　王　進(jìn)　寧寒冰　楊麗敏　(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南　鄭州　450052)

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胞質(zhì)Rap1與胞核NF－κBp65在胃癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性

趙丹王進(jìn)寧寒冰楊麗敏(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南鄭州450052)

〔摘要〕目的探討胞漿Rap1和胞核NF－κB p65在胃癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)92例胃癌及癌旁正常組織Rap1和NF－κB p65的表達(dá)。結(jié)果胃癌組織胞質(zhì)Rap1平均染色評(píng)分為6．53±0．38，明顯高于癌旁正常組織( 1．70±0．10，P＜0．001)。Rap1胞質(zhì)表達(dá)水平與胃癌的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)( P＜0．05)，與年齡、性別無(wú)關(guān);胃癌組織胞核NF－κB p65表達(dá)明顯高于癌旁正常組織( 7．12±0．42 vs 1．74±0．05，P＜0．001)。胞質(zhì)Rap1和胞核NF－κB p65在胃癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)( Kendall'stau－b= 0．447，P＜0．001)。結(jié)論胃癌組織Rap1胞質(zhì)表達(dá)可能與NF－κB介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，共同參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。

〔關(guān)鍵詞〕Rap1; NF－κB p65;胃癌

端粒是位于染色體末端的DNA－蛋白結(jié)構(gòu)，由TTAGGG重復(fù)序列和大量的端粒結(jié)合蛋白組成。六個(gè)端粒結(jié)合蛋白TRF1、TRF2、Rap1、POT1、TIN2和TPP1組成Shelterin復(fù)合體〔1，2〕。大量的研究證明端粒結(jié)合蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Rap1是TRF2相互作用因子，在端粒與TRF2組成Shelterin復(fù)合體的亞單位，人類(lèi)細(xì)胞胞質(zhì)中存在一定數(shù)量的Rap1蛋白，這部分Rap1不與TRF2結(jié)合且不受TRF2表達(dá)水平的影響。Rap1主要在端粒發(fā)揮作用，Rap1蛋白也具有端粒外功能〔3～5〕，近期研究表明胞質(zhì)Rap1蛋白與IκB激酶( IKKs)相互作用，磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子( NF)－κB的p65亞基，激活NF－κB。在乳腺癌組織中胞質(zhì)Rap1表達(dá)增加〔6〕，但Rap1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)Rap1、NF－κB p65在胃癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性，探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用及臨床意義。

1材料和方法

1. 1材料收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年4月至2015 年7月92例胃癌及癌旁正常組織石蠟標(biāo)本。所取標(biāo)本均通過(guò)了鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，全部患者均知情同意，且術(shù)前均未接受化、放療及免疫治療。男56例，女36 例;年齡40～83歲，≤60歲41例，＞60歲51例，中位年齡50．3歲。病理分型均為腺癌:高分化30例，中分化34例，低分化28 例; TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期53例;不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。鼠抗人Rap－1單克隆抗體和鼠抗人NF－κB p65單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司; SP試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1. 2方法所有標(biāo)本均經(jīng)40 g/L甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后切成厚約4 μm切片，脫蠟水化，高溫高壓修復(fù)，應(yīng)用SP免疫組織化學(xué)染色法，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以已知的陽(yáng)性胃癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液( PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。

1. 3結(jié)果判定陽(yáng)性細(xì)胞染色呈棕黃色或棕褐色。Rap1為胞質(zhì)與胞核著色，以胞質(zhì)著色判斷為陽(yáng)性。NF－κB p65為胞質(zhì)與胞核著色，以胞核著色判斷為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的百分比評(píng)分( R) : 0分，＜1%; 1分，2%～25%; 2分，26%～50%; 3分，51%～75%; 4分，＞75%;按照染色強(qiáng)度評(píng)分( I) :不著色，0分;淡棕色，1分;棕色，2分;深棕色，3分;總分為R×I:陰性，0～1分;弱陽(yáng)性，2～4分;中度陽(yáng)性，5～8分;強(qiáng)陽(yáng)性，9～12分。每張切片由兩位高年資病理科醫(yī)師雙盲隨機(jī)觀察。

1. 4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS21．0軟件行t檢驗(yàn)、Mann－Whitney U檢驗(yàn)和Kendall tau rank correlation co－efficient相關(guān)性分析。

2結(jié)果

2. 1 Rap1在胃癌和癌旁正常組織中的表達(dá)Rap1在癌旁正常組織主要為胞核染色，胞質(zhì)染色較弱(圖1A)，胞質(zhì)平均染色評(píng)分為1．70±0．10;胃癌組織胞質(zhì)Rap1表達(dá)增加(圖1B～圖1D)，平均染色評(píng)分為6．53±0．38，明顯高于癌旁正常組織( P＜0．001)。Rap1胞質(zhì)表達(dá)水平與胃癌的分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)( P＜0．05)，與年齡、性別不相關(guān)。見(jiàn)表1。

2. 2 NF－κB p65在胃癌和癌旁正常組織中的表達(dá)胃癌組織胞核NF－κB p65平均染色評(píng)分為7．12±0．42，明顯高于癌旁正常組織( 1．74±0．05，P＜0．001)。

2. 3胞質(zhì)Rap1表達(dá)和胞核NF－κB p65表達(dá)的相關(guān)性胞質(zhì)Rap1和胞核NF－κB p65在胃癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)( Kendall'stau－b=0．447，P＜0．001)。

A: Rap1在癌旁正常組織中的表達(dá); B: Rap1在高分化胃癌組織中的表達(dá); C: Rap1在中分化胃癌組織中的表達(dá); D: Rap1在低分化胃癌組織中的表達(dá); E: NF－κB p65在胃癌中的表達(dá)圖1 Rap1在胃癌及癌旁正常組織及NF-κB p65在胃癌組織中的表達(dá)( SP×200，嵌入小圖×400)

表1胃癌組織中胞質(zhì)Rap1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系( n)

3討論

胃癌早期多無(wú)明顯癥狀或癥狀不典型，絕大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期，生存率低，預(yù)后差〔7〕。因此，對(duì)于胃癌的相關(guān)基礎(chǔ)及臨床研究，顯得愈發(fā)重要。

Rap1作為端粒Shelterin復(fù)合體的核心蛋白之一，最初是在釀酒酵母菌中被發(fā)現(xiàn)的〔5〕。目前研究表明哺乳動(dòng)物Rap1至少具有2種端粒外功能:轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在胞質(zhì)激活NF－κB信號(hào)通路〔3～5〕。最新研究提示Rap1可能通過(guò)端粒外功能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展: Rap1在乳腺癌細(xì)胞質(zhì)表達(dá)增加，通過(guò)激活NF－κB信號(hào)系統(tǒng)促進(jìn)轉(zhuǎn)移性和侵襲性，增加對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑的耐受性〔6〕; Rap1通過(guò)調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)與TRF2共同參與胃癌多藥耐藥的發(fā)生〔8〕。本研究結(jié)果提示胞質(zhì)Rap1表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

Teo等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)Rap1與IKKs形成復(fù)合體，通過(guò)IKKs介導(dǎo)NF－κB p65亞單位的磷酸化，而非通過(guò)磷酸化抑制蛋白IκBs，從而激活NF－κB信號(hào)系統(tǒng)。NF－κB信號(hào)通路已被證實(shí)在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要促進(jìn)作用〔9〕。本研究結(jié)果顯示，Rap1胞質(zhì)表達(dá)可能與NF－κB介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，共同參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，胃癌組織Rap1胞質(zhì)表達(dá)可能與NF－κB介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，共同參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，深入研究Rap1的非端粒功能將為胃癌的診斷和治療提供新的思路。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015－02－13修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者:王進(jìn)( 1958－)，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事消化系腫瘤方面的研究。

基金項(xiàng)目:河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項(xiàng)目( No．201303019)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202( 2016) 02-0350-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 044

第一作者:趙丹( 1989－)，女，在讀碩士，主要從事消化系腫瘤方面的研究。