盧金福許惠琴張志芬王兆龍李　娟　喻　斌呂高虹(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇　南京　003)

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大柴胡顆粒治療高脂飼料致豚鼠膽囊炎的機制

盧金福1許惠琴1張志芬2王兆龍2李娟喻斌1呂高虹1
(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023)

〔摘要〕目的探討大柴胡顆粒治療慢性膽囊炎的機制。方法將豚鼠隨機分為空白對照組、模型組、低、高劑量大柴胡顆粒組( 4、8 g/kg)組、消炎利膽片組( 1．2 g/kg)。采用飲飼法復(fù)制膽囊炎豚鼠模型，觀察大柴胡顆粒對膽囊炎豚鼠血清內(nèi)皮素( ET)、一氧化氮( NO)、腫瘤壞死因子( TNF)－α含量的影響。利用免疫組化的方法，觀察膽囊組織腫瘤壞死因子( TNF)－α表達(dá)情況。結(jié)果大柴胡顆粒大劑量組可顯著提高膽囊炎豚鼠血清ET含量( P＜0．01)，并可顯著降低膽囊組織TNF－α表達(dá)( P＜0．05)。但大柴胡顆粒組對血清NO、TNF－α含量均未見明顯影響。結(jié)論大柴胡顆粒對膽囊炎豚鼠的保護(hù)作用可能與提高血清ET水平及降低膽囊組織TNF－α表達(dá)有關(guān)，其他的相關(guān)機制有待進(jìn)一步研究。

〔關(guān)鍵詞〕大柴胡顆粒;慢性膽囊炎;高脂飼料

1江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室

2南通精華制藥股份有限公司

第一作者:盧金福( 1964－)，男，副教授，博士，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

大柴胡顆粒( DG)是在大柴胡湯基礎(chǔ)上研制而成的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑。大柴胡湯出自張仲景的《傷寒論》，具有外解少陽、內(nèi)瀉熱結(jié)的功效，用于治療少陽陽明合病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用于膽囊炎、膽石癥等疾病的治療。前期研究發(fā)現(xiàn)DG能顯著降低膽汁總膽紅素水平，能明顯減輕膽囊組織炎細(xì)胞的浸潤、組織水腫等病變，顯示其對實驗性慢性膽囊炎有較好的治療作用，但其詳細(xì)的機制不甚清楚，本文從多種生化指標(biāo)的變化及免疫組化的角度試圖對大柴胡顆粒治療慢性膽囊炎的機制作進(jìn)一步的探索。

1材料與方法

1. 1藥品與試劑膽囊炎飼料〔1〕:在普通飼料中加入酪蛋白1%、蔗糖1．5%、豬油1%、纖維素1%、膽酸0．02%、膽固醇0．05%，由南京青龍山實驗動物養(yǎng)殖場提供。消炎利膽片( XYLD，惠州大亞制藥股份有限公司)。DG南通精華制藥有限公司。腫瘤壞死因子( TNF)－α、內(nèi)皮素( ET)試劑盒(放免法)，北京華英生物技術(shù)研究所。一氧化氮( NO)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1. 2實驗儀器DNA Expert GENios酶標(biāo)儀，奧地利。r－911全自動放免計數(shù)儀，中國科技大學(xué)實業(yè)總公司生產(chǎn)。TP 1020自動脫水機:德國LEICA公司產(chǎn)品; RM2235型石蠟切片機:德國LEICA公司產(chǎn)品; CS－Ⅵ型攤片烤片機:湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司。Tissue－Tek TEL組織包埋中心:日本SAKURA公司產(chǎn)品; LEICA DM 1000光學(xué)顯微鏡:德國Leica公司產(chǎn)品;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠; MiniSee圖像采集系統(tǒng)。

1. 3動物豚鼠，普通級，350～450 g，雌雄兼用，由南京青龍山實驗動物養(yǎng)殖場提供。

1. 4分組及給藥方法取健康豚鼠，隨機分組，即空白對照組、模型組、消炎利膽片組、低、高劑量大柴胡顆粒組。除空白對照組喂以普通飼料外，其余動物均喂以膽囊炎專用高脂飼料，空白對照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水，消炎利膽片組給予消炎利膽片1．2 g/kg，低、高劑量大柴胡顆粒組分別給予4 g/kg、8 g/kg，連續(xù)給藥30 d，末次給藥后禁食12 h后，豚鼠稱重，頸總動脈取血，分離血清，測定血清中TNF－α、ET含量、NO。取膽囊用甲醛固定，石蠟包埋、切片，用免疫組化法檢測膽囊組織TNF－α受體的表達(dá)。

1. 5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS11．0軟件進(jìn)行t檢驗。

2結(jié)果

2. 1各組大鼠血清ET、NO、TNF－α水平檢測膽囊炎豚鼠血清NO、TNF－α含量未見明顯變化，但模型組ET有明顯降低，大劑量大柴胡顆粒組給藥后有顯著提高。見表1。

表1各組大鼠血清ET、NO、TNF-α水平檢測(±s，n=13)

表1各組大鼠血清ET、NO、TNF-α水平檢測(±s，n=13)

與空白對照組比較: 1) P＜0．01，與模型組比較: 2) P＜0．05

組別　ET( pg/ml)　 NO(μmol/L)　 TNF－α( ng/ml)空白對照組　84．74±11．58　 3．18±1．33　 1．22±0．39模型組　73．63±9．221)　4．67±7．63　 1．17±0．45消炎利膽片組　89．74±14．112)　3．96±3．56　 1．28±0．48低劑量大柴胡顆粒組　71．04±10．51　 3．94±4．86　 1．14±0．38高劑量大柴胡顆粒組　84．93±10．942)　22．49±34．40　 1．26±0．23

2. 2大柴胡顆粒對高脂飼料致膽囊炎豚鼠膽囊組織TNF－α表達(dá)的影響根據(jù)病理組織檢查半定量的結(jié)果進(jìn)行賦值: +給予1分，?給予2分，?給予3分，并對賦值進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比( 1．00±0)，模型組膽囊組織TNF－α陽性表達(dá)率顯著提高( 2．29±0．49)，但高劑量大柴胡顆粒組給藥后膽囊組織TNF－α陽性表達(dá)率顯著下降( 1．71±0．49)。消炎利膽片組與小劑量大柴胡顆粒組膽組織，TNF－α〔( 2．43±0．53)、( 2．14±0．69)〕無明顯差異( P＞0．05)，見圖1。

圖1各組大鼠膽囊組織TNF-α表達(dá)( DAB，×200)

3討論

慢性膽囊炎從臨床癥狀分析，其應(yīng)歸屬于中醫(yī)學(xué)的“脅痛”、“膽脹”范疇。唐孫思邈在《備急千金要方》膽腑論篇中也提到“病苦腹中氣滿，飲食不下，咽干，頭痛，灑灑惡寒，脅痛，名曰膽實熱也”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病多因結(jié)石刺激、細(xì)菌感染、病毒性肝炎、化學(xué)性損害、寄生蟲及急性膽囊炎遷延等引起，一般采用解痙止痛、控制感染、利膽、手術(shù)等治療〔2〕。目前，慢性膽囊炎的動物模型主要有飲飼法〔1〕、石膽酸型〔3〕等。中醫(yī)認(rèn)為，膽囊炎的發(fā)病與飲食不節(jié)、精神抑郁等多種因素相互作用有關(guān)，其發(fā)病機制與濕熱內(nèi)盛、肝膽氣滯或氣郁化熱有關(guān)。因此本研究同樣從飲食不節(jié)的角度采用飲飼法造模，以此觀察藥物的作用。ET不僅存在于血管內(nèi)皮，也廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中，是調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子，對維持基礎(chǔ)血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)起重要作用。有關(guān)ET與膽囊炎的關(guān)系，McCartney等〔4〕用ELISA法對膽囊炎患者膽囊組織的ET含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)ET含量與膽囊炎炎癥程度呈反比關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，模型組ET有明顯的降低，給予大柴胡顆粒后有顯著提高，參照佘靖等〔5，6〕的研究結(jié)果，大柴胡顆粒對膽囊炎的治療作用較為肯定。然而，國內(nèi)的文獻(xiàn)報道與此不完全一致，有人認(rèn)為ET含量與膽囊炎無明顯關(guān)系，而NO隨膽囊炎發(fā)展而升高，但也有人認(rèn)為，脅肋疼痛較重者血漿ET水平明顯高于脅肋疼痛較輕者及正常人，NO水平別無明顯差異;脘腹痞滿較重者血漿NO水平明顯高于脘腹痞滿較輕者，ET無明顯差異。ET/NO是一對重要的由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有多種生理效應(yīng)，對兩者在膽囊炎發(fā)生發(fā)展中的作用有待進(jìn)一步深入研究。大柴胡顆粒的大劑量能顯著抑制膽囊炎組織TNF－α含量的提高，提示大柴胡顆粒對慢性膽囊炎的治療作用，然而TNF－α的血清水平未見升高，這可能與膽囊炎是局部炎癥或炎癥不夠嚴(yán)重有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

1王玉春，蘇富琴，苗術(shù)，等．金茵顆粒劑抗豚鼠膽囊炎的實驗研究〔J〕．醫(yī)學(xué)研究雜志，2008; 37( 9) : 90－1．

2楊維建，李娟，汪佳明，等．慢性膽囊炎中醫(yī)治療研究進(jìn)展〔J〕．西部中醫(yī)藥，2011; 24( 12) : 95－7．

3余成浩．清膽顆粒劑治療膽囊炎的主要藥效學(xué)實驗研究〔D〕．成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)，2003．

4 McCartney SA，Greaves RR，Warner TD，et al．Endothelin content，expression，and receptor type in normal and diseased human gallbladder〔J〕．Dig Dis Sci，2002; 47( 8) : 1786－92．

5佘靖，張炳厚，劉紅旭，等．肝膽濕熱型慢性膽囊炎一氧化氮、內(nèi)皮素水平及中藥治療影響〔J〕．中國中醫(yī)藥信息雜志，2001; 8( 5) : 42－4．

6王華．慢性膽囊炎肝膽濕熱證與客觀指標(biāo)關(guān)系的研究〔D〕．濟(jì)南:山東中醫(yī)藥大學(xué)，2009．

〔2014－03－17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者:許惠琴( 1961－)，女，教授，博士，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

基金項目:江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專項課題( BA2010094) ;江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(中藥學(xué)，2011)

〔中圖分類號〕R575

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0296-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 019