王麗娜　王冬梅　宋紅敏　齊佳悅　王新成　(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林　吉林　132013)

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復(fù)方穿蛭透皮貼對家兔骨關(guān)節(jié)炎的作用機制

王麗娜王冬梅宋紅敏齊佳悅王新成(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013)

〔摘要〕目的研究探討復(fù)方穿蛭透皮貼對家兔實驗性骨關(guān)節(jié)炎作用機理。方法健康清潔級新西蘭白兔，隨機分為空白組、模型組和治療組。治療組及模型組進(jìn)行改良Hulth法造模。造模成功后，治療組予復(fù)方穿蛭透皮貼右膝關(guān)節(jié)外敷，2d 1次，4 w后分別進(jìn)行X線和HE染色檢查，并抽取3組關(guān)節(jié)液，用ELISA法檢測白細(xì)胞介素( IL)－1β、IL－6、腫瘤壞死因子( TNF)－α和前列腺素( PG) E2的含量。結(jié)果治療組經(jīng)X線檢查，股骨髁、脛骨平臺關(guān)節(jié)緣呈現(xiàn)唇樣骨質(zhì)增生不同程度變小，關(guān)節(jié)間隙寬，軟骨下骨質(zhì)密度淡化; HE染色較均勻，關(guān)節(jié)軟骨表面平滑，關(guān)節(jié)軟骨表層細(xì)胞排列輕度變形;關(guān)節(jié)液中IL－1β、IL－6、TNF－α和PGE 2的含量的含量水平顯著下降( P＜0．05)。結(jié)論復(fù)方穿蛭透皮貼對骨關(guān)節(jié)炎有一定的抑制作用。

〔關(guān)鍵詞〕復(fù)方穿蛭透皮貼;骨關(guān)節(jié)炎;細(xì)胞因子

骨關(guān)節(jié)炎( OA)患者常出現(xiàn)局部關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹及功能障礙等癥狀，嚴(yán)重地影響生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)〔1〕，細(xì)胞因子白細(xì)胞介素( IL)－1、IL－8、IL－6、腫瘤壞死因子( TNF)－α和前列腺素( PG) E2等是骨關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的主要因素〔1～3〕。復(fù)方穿蛭透皮貼處方由中藥甲珠、阿魏、三七、水蛭等十余味藥材組成，臨床治療OA療效顯著?，F(xiàn)代藥理研究表明，阿魏、水蛭、三七均具有抗炎作用;水蛭注射液可以明顯降低腦組織TNF－α和IL－1β的含量，能夠抗腦缺血后炎癥反應(yīng)，從而起到腦保護作用;三七皂苷可以明顯抑制炎癥引起的脂質(zhì)沉積的增加，同時減少炎癥細(xì)胞因子TNF－α和IL－1的產(chǎn)生〔4，5〕。本實驗旨在研究現(xiàn)代純中藥制劑復(fù)方穿蛭透皮貼對兔膝OA細(xì)胞因子IL－1β、IL－6、TNF－α及PGE2的影響及作用機制。

1材料與方法

1. 1動物資料新西蘭白兔36只(購于吉林醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心)，體質(zhì)量2．0～2．5 kg，雌雄各半，室溫下飼養(yǎng)。隨機分為空白組，模型組和治療組，每組12只。除空白組外，模型組和治療組造模之后，開始連續(xù)給藥4 w，模型組不作任何處理，治療組用透皮貼( 0．45 g/每貼)貼敷患側(cè)膝關(guān)節(jié)，紗布固定，每2 d換藥1次。復(fù)方穿蛭透皮貼(自制) :實驗用中藥材均購于吉林大藥房，經(jīng)質(zhì)量檢查，符合《中國藥典》2010年版(Ⅰ部)相關(guān)項下規(guī)定。試劑IL－1β、IL－6、TNF－α及PGE2的ELISA試劑盒，購于上海慧穎生物科技有限公司。

1. 2動物模型制備采用改良Hulth法造模。將實驗兔右膝關(guān)節(jié)消毒麻醉后進(jìn)行膝前內(nèi)側(cè)切口，使關(guān)節(jié)暴露并切斷關(guān)節(jié)前交叉韌帶及內(nèi)側(cè)半月板，止血，關(guān)閉傷口。術(shù)后不固定患肢，使其于標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)籠中自由活動并可進(jìn)食。術(shù)后肌注青霉素20萬U，傷口連續(xù)7 d換藥。術(shù)后1 w每日強迫活動30 min，分2次驅(qū)趕，4 w后可獲得OA模型。

1. 3取材及處理治療前和末次治療后，分別拍攝兔右膝關(guān)節(jié)X線側(cè)位片?？瞻捉M、模型組以生理鹽水1 ml右后腿膝關(guān)節(jié)腔注射，治療組右膝關(guān)節(jié)貼敷，并用紗布固定，2 d換藥1次，共4 w后，抽取右后腿膝關(guān)節(jié)液。施行膝關(guān)節(jié)穿刺，證實刺入關(guān)節(jié)腔后，注入0．9%的生理鹽水0．5 ml，反復(fù)回抽、注入3次后，再盡量抽出腔內(nèi)液體。抽取關(guān)節(jié)液后，每只兔肌注2萬U慶大霉素，以防膝關(guān)節(jié)感染。各實驗兔獲得標(biāo)本量在0．4～0．6 ml，平均0．5 ml，于－20℃低溫冰箱中保存待測?？諝馑ㄈ幩缹嶒炌茫」晒嵌诉M(jìn)行病理學(xué)觀察。

1. 4蘇木素－伊紅( HE)染色每例標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，10%硝酸脫鈣后，取材得到股骨內(nèi)側(cè)髁矢狀剖面標(biāo)本1塊。經(jīng)石蠟包埋，切片后，用HE染色，置顯微鏡下觀察。

1. 5檢測方法采用雙抗體ELISA法測定IL－1β、IL－6、TNF－α 及PGE2:關(guān)節(jié)液標(biāo)本處理加樣后，置于4℃恒溫箱內(nèi)靜置24 h，取出加入分離劑充分混勻，4℃溫度下離心2 min，棄去上清液，由自動放免測量儀測定樣品濃度。

1. 6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS12．5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2. 1 X線檢查空白組膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙均勻一致，股骨髁、脛骨平節(jié)面輪廓清晰;模型組股骨髁、脛骨平臺關(guān)節(jié)緣出現(xiàn)唇樣骨質(zhì)改變，關(guān)節(jié)間隙變窄;治療組股骨髁、脛骨平臺關(guān)節(jié)緣呈現(xiàn)唇樣骨質(zhì)增生不同程度變小，關(guān)節(jié)間隙寬，軟骨下骨質(zhì)密度淡化。見圖1。

圖1兔膝骨關(guān)節(jié)X線片

2. 2 HE染色空白組關(guān)節(jié)軟骨面光滑整齊，無裂隙或缺損，軟骨細(xì)胞數(shù)量中等，排列整齊，間質(zhì)均勻。模型組關(guān)節(jié)軟骨組織嚴(yán)重破壞，關(guān)節(jié)軟骨表面缺損，軟骨表面粗糙，可見表層基質(zhì)有丟失，軟骨基質(zhì)染色不均，細(xì)胞分布不均勻。關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生了退變，膝OA模型成功。治療組關(guān)節(jié)軟骨表面平滑，細(xì)胞部分缺失，分層較清楚，關(guān)節(jié)軟骨表層細(xì)胞排列輕度變形，染色較均勻。見圖2。

2. 3細(xì)胞因子測定模型組關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子IL－1β、IL－6、TNF－α及PGE2的含量與空白組差異均顯著( P＜0．05) ;治療組與模型組差異顯著( P＜0．05)。見表1。

圖2兔膝骨關(guān)節(jié)HE染色(×100)

表1各組關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子水平比較(±s，ng/ml，n=12)

表1各組關(guān)節(jié)液中細(xì)胞因子水平比較(±s，ng/ml，n=12)

與空白組比較: 1) P＜0．05，2) P＜0．01;與模型組比較: 3) P＜0．05，4) P＜0．01

組別　IL－1β　IL－6　TNF－α　PGE2空白組　5．128±1．427　 11．475±0．125　 1．211±3．524　 3．127±6．354模型組　27．012±0．2451)36．587±0．3652)15．204±3．0121)26．104±1．9571)治療組14．396±1．2871) 3)20．042±2．5411) 4)11．144±0．7822) 3)23．210±0．6732) 3)

3討論

復(fù)方穿蛭透皮貼具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的作用。該制劑是在傳統(tǒng)貼膏劑穿蛭膏的基礎(chǔ)上，改進(jìn)制劑工藝，加入透皮吸收促進(jìn)劑促進(jìn)藥物有效成分的釋放、吸收，使制劑臨床療效明顯提高。本實驗結(jié)果表明，復(fù)方穿蛭透皮貼能夠抑制細(xì)胞因子IL－1β、IL－6、TNF－α及PGE2的釋放，改變軟骨細(xì)胞代謝環(huán)境并對OA具有抑制作用。此外，復(fù)方穿蛭透皮貼與其傳統(tǒng)膏劑穿蛭膏相比較，其對細(xì)胞因子IL－1β和TNF－α的抑制率分別提高了8．2%和9．0%〔6〕，說明采用現(xiàn)代制劑工藝，利用經(jīng)皮給藥技術(shù)，制劑處方中加入促進(jìn)吸收滲透劑可顯著提高制劑療效。

4參考文獻(xiàn)

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3梁健芬，董少龍，竇維華，等．水蛭注射液對大鼠腦缺血再灌注后TNF－α、IL－1β和ICAM－1蛋白表達(dá)的影響〔J〕．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2006; 35( 12) : 1605－7．

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〔2014－11－29修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者:王新成( 1968－)，男，副主任技師，主要從事中藥新藥研發(fā)研究。

基金項目:吉林省教育廳重點資助項目(吉教科合字〔2011〕第283號)

〔中圖分類號〕R285. 5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0290-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 015

第一作者:王麗娜( 1978－)，女，副教授，碩士，主要從事中藥制劑與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。