凌云志　禹　莉梁啟勝　李曉紅　林學(xué)武　(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽　蚌埠　233004)

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老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后神經(jīng)營養(yǎng)因子、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶及突觸素的改變

凌云志禹莉1梁啟勝李曉紅林學(xué)武(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽蚌埠233004)

〔摘要〕目的探討老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后對血清膠質(zhì)細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子( GDNF)、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶( CHAT)及海馬內(nèi)突觸素蛋白表達的影響。方法SD老年大鼠35只隨機分為三組:空白組( K組，n=7)、對照組( D組，n= 14)、手術(shù)組( S組，n= 14)。D、S組根據(jù)處理時間不同各分2個亞組，D1、D3、S1、S3組(每組7只)。酶聯(lián)免疫吸附法( ELISA)檢測血清GDNF、CHAT濃度，HE染色檢測海馬組織病理變化，免疫組化檢測海馬內(nèi)突觸素蛋白的表達。結(jié)果S組血清GDNF、CHAT濃度均降低，與K組、D組相比差異顯著( P＜0．05) ; HE染色顯示D組和S組神經(jīng)細胞缺失，形態(tài)改變;免疫組化結(jié)果表明D組和S組突觸素表達較K組明顯下降( P＜0．01，P＜0．05)。結(jié)論老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力下降可能與血清GDNF、CHAT濃度降低，海馬內(nèi)突觸素蛋白表達下調(diào)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕股骨頸骨折;神經(jīng)營養(yǎng)因子;乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶;突觸素

1蚌埠醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系

第一作者:凌云志( 1977－)，男，博士，主治醫(yī)師，講師，主要從事麻醉腦保護研究。

術(shù)后認知功能障礙( POCD)是一種麻醉、手術(shù)后較為嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，是指手術(shù)后數(shù)天內(nèi)發(fā)生的意識、認知、定向、思維、記憶以及睡眠等方面的紊亂，是老年患者術(shù)后早期較為顯著的問題〔1〕。臨床觀察到骨科手術(shù)后，POCD的發(fā)生率相對較高，Berggren等〔2〕發(fā)現(xiàn)老年患者股骨頸骨折固定術(shù)后POCD的發(fā)生率高達44 %，由于病因仍不很清楚，給臨床上預(yù)防和治療帶來一定困難。本課題組前期研究結(jié)果表明〔3〕老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后可暫時影響大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，可能與血清Aβ1～40濃度升高以及海馬內(nèi)Bcl－2/Bax比例降低有關(guān)。本實驗進一步探討POCD的發(fā)生機制。

1材料與方法

1. 1實驗動物及分組35只健康雄性清潔級SD大鼠由浙江省實驗動物中心提供，合格證號: SCXK(浙) 20080033。月齡18～20個月，體質(zhì)量450～500 g，實驗前12 h禁食不禁水。采用隨機數(shù)字表法分為五組: K組( n = 7)為空白組，不做任何麻醉及手術(shù)處理; D組( n = 14)為對照組，僅制作股骨頸骨折模型; S組( n=14)為手術(shù)組，制作股骨頸骨折模型，麻醉后行股骨頸骨折內(nèi)固定術(shù)。D組、S組大鼠根據(jù)處理時間的不同各分為2個亞組，每組7只，分別為處理后1、3 d組(即D1、D3; S1、S3組)。

1. 2手術(shù)處理老年大鼠左股骨頸骨折模型制作成功后，行2%戊巴比妥鈉2．5 ml/kg腹腔注射麻醉，待大鼠翻正反射消失后仰臥位固定，保持氣道通暢。切開右腹股溝皮膚，游離暴露股靜脈，然后進行小兒B－D套管針置管，建立靜脈通道，乳酸鈉林格注射液靜脈維持輸液，固定包埋套管針，縫合皮膚。常規(guī)消毒鋪巾，在左側(cè)股骨頸骨折部位，選擇后外切口，切開皮膚、筋膜，分離肌層，暴露骨折斷端，使用1．0 mm克氏針行骨折斷端交叉固定，徹底止血后，逐層關(guān)閉縫合傷口，青霉素鈉粉劑灑在傷口表面，術(shù)中呼吸平穩(wěn)。術(shù)后傷口愈合好，分籠喂養(yǎng)，無手術(shù)死亡。

1. 3材料大鼠膠質(zhì)細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子( GDNF) ELISA試劑盒及乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶( CHAT) ELISA試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司) ;兔抗突觸素抗體(美國Santa Cruz生物技術(shù)公司) ;免疫組化染色試劑盒(美國ZYEMD公司生產(chǎn)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司分裝)

1. 4方法

1. 4. 1取材抽取各組大鼠心臟血液2 ml，放置30 min自然凝固后，3 000 r/min離心10 min，取上清，－20℃保存用于檢測血清GDNF和CHAT，試劑盒及檢測均由上海雅吉生物科技有限公司完成。斷頭處死，迅速開顱取腦，于冰臺上分離出海馬組織，10 %甲醛固定24 h用于HE和免疫組化檢測。

1. 4. 2 HE和免疫組化染色取甲醛固定的海馬組織常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。冠狀切片，片厚4 μm，行HE染色，光鏡觀察海馬CA1區(qū)組織形態(tài)學(xué)變化，其余標(biāo)本行SP免疫組化染色。脫蠟至水，3%過氧化氫封閉15 min，PBS沖洗，加入兔抗突觸素抗體(稀釋比例為1∶150)，為排除非特異性染色，部分切片以PBS代替一抗，37℃孵育2 h，PBS沖洗，加入即用型Ⅱ抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片。海馬區(qū)出現(xiàn)黃褐色點狀或顆粒狀為陽性。在顯微鏡( Olympus，Japan)下觀察突觸素蛋白的表達，用圖像分析系統(tǒng)( Image Pro Plus 6．0，美國)測其平均灰度值。

1. 5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16．0軟件行單因素方差分析及q檢驗。

2結(jié)果

2. 1血清GDNF和CHAT檢測與K組相比，D組、S組血清GDNF、CHAT濃度均降低( P＜0．01，P＜0．05)，與D1組、D3組分別相比，S1組、S3組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0．01，P＜0．05)。見表1。

表1各組大鼠血清GDNF和CHAT濃度比較( n=7±s)

表1各組大鼠血清GDNF和CHAT濃度比較( n=7±s)

與K組比較: 1) P＜0．05，2) P＜0．01;與D1組比較3) P＜0．05，4) P＜0．01;與D3組比較: 5) P＜0．05，6) P＜0．01

組別　GDNF( ng/L)　CHAT( pmol/L) K組　84．16±6．62　323．11±49．49 D1組　69．76±9．682)　262．60±28．432)D3組　71．88±8．371)　281．74±29．691)S1組　56．58±12．062) 3) 5)　193．38±38．372) 4) 6)S3組　58．75±9．492) 3) 6)　216．47±39．452) 3) 6)F/P值　9．780/＜0．01　13．054/＜0．01

2. 2 HE染色結(jié)果K組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞排列整齊緊密，形態(tài)完整，數(shù)量較多，胞質(zhì)豐富，胞核飽滿，大而圓，著色均勻，深染，核仁清晰。D1和D3組與K組相比，神經(jīng)細胞有缺失，數(shù)量減少，細胞排列散亂，膠質(zhì)細胞稀疏變性，S1和S3組與K組相比，神經(jīng)細胞缺失更明顯，殘留的神經(jīng)細胞排列松散不規(guī)則，邊界模糊，邊緣出現(xiàn)空泡，胞核不規(guī)則，有的胞核消失，染色較淺，細胞數(shù)量明顯減少，神經(jīng)元胞體變小，見圖1。

2. 3免疫組化檢測結(jié)果從圖2可以看出突觸素免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈板層分布，神經(jīng)元內(nèi)免疫陽性物質(zhì)為棕黃色點狀或顆粒狀沉積。有些顆粒圍繞在神經(jīng)元周圍，襯托出神經(jīng)元胞體的輪廓。K組海馬神經(jīng)細胞周圍突觸素陽性染色顆粒較密集，染色較深且明顯，錐體細胞排列緊密，整齊，結(jié)構(gòu)清晰。D1和D3組海馬神經(jīng)細胞周圍突觸素陽性染色顆粒明顯減少，稀疏，錐體細胞排列較疏松，細胞層次減少。S1和S3組突觸素免疫陽性顆粒數(shù)量減少更明顯，染色較淺且分布更為稀疏，低于K組和D組。定量分析結(jié)果顯示D1和D3組海馬CA1區(qū)突觸素免疫反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度值〔( 124．71±22．71)、( 119．29± 13．49)〕較K組〔( 147．14±21．88)〕明顯降低，突觸素表達下降( P＜0．05)，S1和S3組〔( 93．57±15．99)、( 96．86±18．63)〕較K組突觸素表達平均灰度值降低更明顯( P＜0．01)，S1和S3組分別與D1和D3組相比差異顯著( P＜0．01，P＜0．05)。

圖2各組突觸素蛋白表達的結(jié)果( DAB，×100)

3討論

GDNF來源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞，是GDNF家族中的主要成員之一，發(fā)揮營養(yǎng)神經(jīng)、抑制神經(jīng)元變性壞死等作用，是對神經(jīng)細胞的存活、增殖、分化、凋亡和軸突形成等多方面起調(diào)節(jié)作用的GDNF〔4，5〕。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中GDNF存在多種相互關(guān)聯(lián)的信號傳導(dǎo)通路，能夠促進發(fā)育中神經(jīng)元的存活、分化及正確遷移〔6〕。GDNF還可以對由各種原因造成損傷后的神經(jīng)細胞有保護和修復(fù)作用〔7〕。研究報道，GDNF的缺乏與AD的發(fā)病密切相關(guān)〔8〕。有研究表明，將人胚胎神經(jīng)干細胞植入外傷性腦損傷大鼠受損海馬部位時大量表達和釋放GDNF，并顯著改善認知功能，動物空間學(xué)習(xí)和記憶能力顯著提高〔9〕。本實驗結(jié)果說明老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后，血清GDNF濃度降低，這可能是影響老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后認知功能障礙的原因之一。

乙酰膽堿作為腦內(nèi)廣泛分布的重要神經(jīng)遞質(zhì)，與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系極為密切。CHAT是乙酰膽堿合成的限速酶，可作為膽堿能神經(jīng)元活性的標(biāo)志，癡呆老齡鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低與膽堿能神經(jīng)密切相關(guān)，進一步的實驗證明CHAT活性變化能夠判斷膽堿能神經(jīng)功能，CHAT活性降低是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙的重要原因〔10，11〕。Dunbar等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)水迷宮作業(yè)表現(xiàn)較好的大鼠海馬中乙酰膽堿化酶活性和膽堿攝取量較高。腦的活栓和尸檢清楚地顯示在老年性癡呆患者腦皮層CHAT活性顯著降低，且CHAT水平與神經(jīng)炎性斑和MMSE簡易智能量表成績高度相關(guān)。本實驗結(jié)果說明老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后血清CHAT濃度降低，這可能是導(dǎo)致老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后學(xué)習(xí)記憶能力下降，發(fā)生術(shù)后認知功能障礙的原因之一。

海馬是神經(jīng)元退行性變發(fā)生的易感區(qū)域，海馬神經(jīng)元的退變和丟失是正常老化的最常見的特點，也是導(dǎo)致與老化相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶功能減退的直接原因。本文結(jié)果說明老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后發(fā)生神經(jīng)元細胞的缺失與退變，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能的減退。

突觸是神經(jīng)元之間的功能接觸部位，其結(jié)構(gòu)和功能的完整對神經(jīng)元的信息傳遞、加工和貯存十分重要。學(xué)習(xí)記憶與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸的結(jié)構(gòu)和功能的可塑性密切相關(guān)。突觸素是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的膜蛋白，可作為突觸前終末特異性標(biāo)記物用來客觀反應(yīng)突觸的密度和分布，已有研究〔13〕發(fā)現(xiàn)突觸素免疫活性與AD患者的認知障礙程度相關(guān)。本實驗結(jié)果說明老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后突觸素表達明顯下降，反映了突觸數(shù)量的減少和突觸素合成能力的減弱，突觸素減少將導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞、加工和儲存出現(xiàn)障礙，神經(jīng)遞質(zhì)釋放異常，最終出現(xiàn)行為功能異常。老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能減退可能與突觸素蛋白表達的減少有直接關(guān)系。

綜上所述，膠質(zhì)細胞系來源的GDNF、膽堿能神經(jīng)元的特異性標(biāo)志酶CHAT和神經(jīng)元突觸的特異性標(biāo)志物突觸素對于維持學(xué)習(xí)記憶功能具有關(guān)鍵的作用，本研究表明，老年大鼠在股骨頸骨折術(shù)后血清GDNF和CHAT濃度的降低、海馬突觸素蛋白表達減少可能是導(dǎo)致老年大鼠股骨頸骨折術(shù)后學(xué)習(xí)記憶能力減退的重要機制。GDNF、CHAT和突觸素能否作為術(shù)后認知功能障礙早期預(yù)測指標(biāo)和治療的靶點還有待于進一步的實驗和臨床研究。

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〔2014－12－19修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

通訊作者:禹莉( 1979－)，女，碩士，副教授，主要從事診斷分子生物學(xué)研究。

基金項目:安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究一般項目( KJ2015B004by) ;蚌埠醫(yī)學(xué)院重點課題( BYKY1424ZD)

〔中圖分類號〕R614. 4

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0287-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 014