馬茜，王辛，王愛紅

(1蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇蘇州215001；2南京中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院)

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動(dòng)物腦缺血性疾病治療中肌肽的給藥途徑、劑量、時(shí)間及其作用機(jī)制研究進(jìn)展

馬茜1,2，王辛2，王愛紅2

(1蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇蘇州215001；2南京中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院)

肌肽在腦缺血性疾病動(dòng)物模型中的給途徑有腹腔注射、靜脈注射及口服，其治療時(shí)間窗為6～9 h，1 000 mg/kg和2 000 mg/kg肌肽腹腔注射具有腦保護(hù)作用，但低劑量(250、500和750 mg/kg)是否具有腦保護(hù)作用尚存在爭(zhēng)議。肌肽主要通過抗氧化、抗炎、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)及抗興奮性毒性作用等機(jī)制實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用。

肌肽；腦缺血性疾病；給藥途徑；神經(jīng)保護(hù)機(jī)制

肌肽是一種由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的內(nèi)源性二肽[1]，廣泛分布在骨骼肌、腦、心臟、腎臟等組織器官中，以骨骼肌和大腦含量最多。肌肽具有抗氧化[2]、抗凋亡[3]、抗炎[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]等作用，臨床已經(jīng)用于癌癥、阿爾茲海默癥、老年性白內(nèi)障、威爾遜氏病、糖尿病等疾病的治療。肌肽可穿透血腦屏障[3]，對(duì)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞損傷的多種機(jī)制均有積極的調(diào)節(jié)作用，是治療腦缺血性疾病的有力候選藥物。很多神經(jīng)保護(hù)劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)對(duì)腦缺血疾病具有神經(jīng)保護(hù)作用，但在臨床試驗(yàn)中卻被驗(yàn)證無(wú)效，目前對(duì)肌肽神經(jīng)保護(hù)作用的研究也還停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，現(xiàn)將肌肽在腦缺血疾病動(dòng)物模型中的給藥途徑、劑量、時(shí)間及其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制作一綜述，為進(jìn)一步臨床試驗(yàn)提供理論指導(dǎo)。

1　給藥途徑

目前，腹腔注射給藥是肌肽在腦缺血性疾病動(dòng)物模型中最普遍的給藥途徑[5,6]，腹腔注射可增強(qiáng)腦缺血大鼠腦組織肌肽的免疫活性，可能與肌肽可直接穿透血腦屏障有關(guān)。另有研究[7]發(fā)現(xiàn)，靜脈注射1 000 mg/kg和2 000 mg/kg肌肽水溶液均對(duì)腦缺血大鼠具有神經(jīng)修復(fù)作用?？诜羌‰牡牧硪环N給藥方式，肌肽可通過特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)被小腸絨毛刷狀緣吸收，通過腸黏膜載體擴(kuò)散入血液并運(yùn)送到腎臟、肝臟和肌肉中被外周組織利用，也可通過肌肽酶水解成丙氨酸和組氨酸供人體利用[8]。王愛紅等[9,10]也發(fā)現(xiàn)，肌肽水溶液灌胃可減輕腦缺血大鼠的神經(jīng)功能受損程度，提高大鼠免疫能力。隋鑫[13]對(duì)肌肽在人工胃液和人工腸液的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肽在胃中可能不穩(wěn)定，臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)將其制成口服腸溶制劑，同時(shí)微酸條件可促進(jìn)肌肽的藥物吸收速度。

2　給藥劑量

肌肽在腦缺血性疾病動(dòng)物模型中的給藥劑量尚無(wú)定論。Zhang等[6]腹腔注射100 mg/kg肌肽可減輕大鼠全腦缺血后腦組織氧化損傷程度。張香敏等[5]則認(rèn)為腹腔注射250 mg/kg肌肽可明顯減輕腦缺血后的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Bae等[7]研究表明，靜脈注射1 000 mg/kg和2 000 mg/kg肌肽均可縮小短暫性腦缺血大鼠腦梗死體積、改善神經(jīng)功能缺損程度，但靜脈注射500 mg/kg肌肽無(wú)法縮小腦梗死體積。Wang等[3]也發(fā)現(xiàn)腹腔注射1 000 mg/kg肌肽可提高短暫性腦缺血大鼠腦組織 中轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)、Pim-1 mRNA及pSTAT3、Pim1、bcl-2蛋白的表達(dá)，最終降低Caspase-3的蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，但500 mg/kg和750 mg/kg肌肽效果不明顯。綜上所述，肌肽的腦保護(hù)作用具有劑量效應(yīng)性，1 000 mg/kg和2 000 mg/kg肌肽具有腦保護(hù)作用，但低劑量(250、500和750 mg/kg)是否具有腦保護(hù)作用尚存在爭(zhēng)議，可能與以往研究的給藥途徑及腦缺血性疾病動(dòng)物模型類型不同有關(guān)。

3　給藥時(shí)間

肌肽對(duì)腦缺血損傷具有預(yù)防作用。隋鑫等[11]在制作小鼠永久性大腦中動(dòng)脈缺血模型前30 min，給小鼠腹腔注射1 000 mg/kg肌肽，可明顯減小腦缺血后小鼠的腦梗死灶，改善神經(jīng)功能，且效果可持續(xù)7 d。Nakase等[12]發(fā)現(xiàn)，術(shù)前30 min為短暫性腦缺血大鼠腹腔注射250 mg/kg肌肽，可發(fā)揮抗氧化和抗凋亡作用,這與Zhang等[6]的研究結(jié)果一致。肌肽對(duì)腦缺血性疾病后的腦損傷也具有治療作用，但其治療時(shí)間窗尚無(wú)定論。Bae等[7]研究顯示肌肽治療時(shí)間窗更長(zhǎng)，針對(duì)短暫性腦缺血有效治療時(shí)間窗為6 h，針對(duì)永久性腦缺血有效治療時(shí)間窗為9 h，效果優(yōu)于目前唯一的腦卒中溶栓劑-重組組織型纖溶酶原激活劑(rtPA)的3～4.5 h治療時(shí)間窗。

4　作用機(jī)制

4.1抗氧化作用氧自由基損傷是腦缺血性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要核心因素之一[12]。腦缺血性疾病后，線粒體被破壞，無(wú)法進(jìn)行有氧氧化，氧化磷酸化水平降低，ATP產(chǎn)生不足，再灌注后血液中的氧只能和線粒體上的各種酶催化生成大量活性氧簇(ROS)，同時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)功能下降，導(dǎo)致體內(nèi)自由基爆發(fā)，造成腦損傷。Stvolinsky等[13]在全腦缺血性疾病再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)肌肽可改善線粒體功能，提高腦組織線粒體氧化磷酸化水平，增加能量合成，降低腦組織線粒體膜上肌酸激酶(CK)和酪氨酸羥化酶(TH)的活力，減少ROS的產(chǎn)生，這與申峰等[14]的研究結(jié)果一致。氧自由基造成腦損傷的主要機(jī)制之一為自由基容易攻擊含有不飽和脂肪酸的細(xì)胞生物膜，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而使生物膜通透性增加，最終造成細(xì)胞壞死。細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化被認(rèn)為是腦缺血性疾病損傷的重要環(huán)節(jié)[15]，丙二醛(MDA)為主要的脂質(zhì)過氧化物，其含量變化可以間接反映組織中氧自由基的含量及組織細(xì)胞的損傷程度[16]。

4.2抗炎作用肌肽可顯著提高腦缺血再灌注大鼠腦組織中熱休克蛋白70(HSP70)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)[17]。HSP70是缺血性腦損傷所誘導(dǎo)的一種神經(jīng)元保護(hù)性物質(zhì)，被認(rèn)為與缺血性腦損害的修復(fù)密切相關(guān)[18]。炎癥是誘導(dǎo)熱休克蛋白產(chǎn)生的一個(gè)應(yīng)激因素，而腦缺血性疾病后強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)是造成腦組織繼發(fā)性損傷的因素之一，炎癥介質(zhì)在這一過程中發(fā)揮重要作用。缺血刺激損傷區(qū)免疫細(xì)胞活化并釋放炎性介質(zhì)，造成腦組織損傷，炎性介質(zhì)又可招募循環(huán)中的中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞進(jìn)入腦缺血性疾病損傷區(qū)產(chǎn)生更多的炎性介質(zhì)，包括細(xì)胞因子、趨化因子和損傷相關(guān)效應(yīng)分子，加重炎性反應(yīng)[19]。

另外，MMPs是鋅依賴的一類蛋白水解酶，存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，可破壞血-腦屏障，使炎性細(xì)胞進(jìn)入大腦[20]，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重腦損傷。而MMP-9是MMPs家族重要成員，在腦梗死的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[21]。Denes等[19]在研究肌肽對(duì)小鼠永久性腦缺血損傷的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，肌肽可明顯減小腦梗死體積，抑制大腦中MMP-9活性和蛋白水平，提示肌肽可通過抑制腦缺血過程中MMP-9的釋放，從而維持血腦屏障的完整性，減輕腦組織炎性損傷。

4.3抗凋亡作用腦缺血幾小時(shí)內(nèi)，缺血半暗帶或梗死區(qū)周圍的神經(jīng)元死亡主要以可逆性的凋亡為主，因此，抑制缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡可以成為腦缺血性疾病治療的重要手段。腦缺血后介導(dǎo)凋亡的通路主要為Caspase依賴的凋亡通路。在此凋亡通路中，有很多凋亡相關(guān)蛋白參與。其中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白及STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞內(nèi)傳感器，腦缺血后，STAT3被激活，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，轉(zhuǎn)化成pSTAT3，許多蛋白均由pSTAT3調(diào)控，其中，Pim-1是絲氨酸/蘇氨酸激酶質(zhì)子家族的一員，STAT3可以激活Pim-1的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

除了Caspase依賴凋亡途徑，非Caspase依賴途徑也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)在非caspase依賴的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)腦缺血性疾病缺氧后，由于氧化應(yīng)激刺激，線粒體內(nèi)膜的通透轉(zhuǎn)換孔打開，導(dǎo)致線粒體外膜破裂，AIF釋放入胞漿，直接進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)核染色質(zhì)濃縮和DNA大片段化[22]。而肌肽預(yù)處理可抑制腦缺血性疾病大鼠腦組織海馬區(qū)AIF的基因和蛋白表達(dá)，減少腦缺血缺氧后神經(jīng)細(xì)胞凋亡[5]。

4.4免疫調(diào)節(jié)作用缺血后繼發(fā)性腦損傷激發(fā)了一系列免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起了嚴(yán)重的外周免疫抑制，造成感染，增加腦卒中后的致殘率和致死率。在這一過程中，快速的T淋巴細(xì)胞減少是主要表現(xiàn)[23]，T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和活性是細(xì)胞免疫功能的直接反映，在細(xì)胞免疫中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，主要由CD3+、CD4+、CD8+輔助性T淋巴細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞等主導(dǎo)，CD4+/CD8+值能初步評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)，比值下降，提示免疫功能受損，是機(jī)體病變程度和預(yù)后不良的重要標(biāo)志之一；比值增加，提示免疫應(yīng)答的正調(diào)節(jié)占優(yōu)勢(shì)[24,25]。王愛紅等[9]的研究顯示，肌肽治療可明顯減輕永久性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損，減小腦梗死體積，提高外周血CD3+、CD4+細(xì)胞水平及CD4+/CD8+，可見肌肽對(duì)可調(diào)節(jié)腦缺血大鼠外周血T淋巴細(xì)胞水平，改善腦缺血后外周免疫抑制狀態(tài)，并發(fā)揮腦保護(hù)作用。

CD4+Th細(xì)胞分為Th1和Th2兩個(gè)亞群，Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2等，Th2細(xì)胞主要分泌抗炎性細(xì)胞因子IL-4、IL-6等，細(xì)胞因子表達(dá)從Th1向Th2漂移是腦缺血后免疫抑制的另一個(gè)表現(xiàn)。而肌肽可逆轉(zhuǎn)Th1和Th2之間的失衡，增加腦缺血大鼠外周血IFN-γ的水平，降低IL-4水平，改善免疫抑制狀態(tài)[12]。

4.5抗興奮性氨基酸毒性在缺血過程中能量快速耗竭引起細(xì)胞內(nèi)外離子濃度差的失衡以及神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞膜電位的下降，缺血區(qū)細(xì)胞外液中興奮性氨基酸(尤其是谷氨酸)顯著上升，造成N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)等谷氨酸受體大量激活。由于NMDA受體對(duì)Ca2+具有高度通透性，當(dāng)其被大量激活后引起大量的Ca2+內(nèi)流，產(chǎn)生興奮性毒性[26]。沈耀等[27]報(bào)道，NMDA可造成與神經(jīng)元在形態(tài)、生理、生化等方面接近的PC12細(xì)胞死亡，而肌肽預(yù)處理可顯著提高細(xì)胞的存活率，其神經(jīng)保護(hù)作用與其能提高細(xì)胞內(nèi)外組氨酸和組胺含量有關(guān)。

綜上所述，肌肽在腦缺血性疾病動(dòng)物模型中可通過抗氧化、抗炎、抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)及抗興奮性毒性作用等機(jī)制實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用。其主要給途徑包括腹腔注射、靜脈注射及口服，治療時(shí)間窗較長(zhǎng)，與rtPA相比，具有明顯優(yōu)勢(shì)。1 000 mg/kg和2 000 mg/kg肌肽具有腦保護(hù)作用，但低劑量(250、500、750 mg/kg)是否具有腦保護(hù)作用尚存在爭(zhēng)議，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，而且，目前肌肽在腦缺血治療方面的研究仍然停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，對(duì)于臨床腦缺血疾病的治療效果及其機(jī)制仍未闡明，應(yīng)加強(qiáng)其臨床應(yīng)用研究。

[1] Boldyrev AA,Dupin AM,Bunin AY,et al.The antioxidative properties of carnosine,a natural histidine containing dipeptide[J].Biochem Int,1987,15(6):1105-1113.

[2] Bellia F,Vecchio G,Cuzzocrea S,et al.Neuroprotective features of carnosine in oxidative driven disease[J].Mol Aspects Med,2011,32(4-6):258-266.

[3] Wang JP,Yang ZT,Liu C,et al.L-carnosine inhibits neuronal cell apoptosis through signal transducer and activator of transcription 3 signaling pathway after acute focal cerebral ischemia[J].Brain Res,2013,1507:125-133.

[4] Ohsawa M,Mutoh J,Asato M,et al.Carnosine has antinociceptive properties in the inflammation-induced nociceptive response in mice[J].Eur J Pharmacol,2012,682(1-3):56-61.

[5] 張香敏,張展,程秀永,等.肌肽對(duì)缺氧缺血性腦損傷大鼠凋亡生化指標(biāo)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué),2014,6(1)：41-44.

[6] Zhang X,Song L,Cheng X,et al.Carnosine pretreatment protects against hypoxia-ischemia brain damage in the neonatal rat model[J].Eur J Pharmacol,2011,667(1-3):202-207.

[7] Bae ON,Serfozo K,Baek SH,et al.Safety and efficacy evaluation of carnosine,an endogenous neuroprotective agent for ischemic stroke[J].Stroke,2013,44(1):205-212.

[8] 羅有文,鄭丹,扶國(guó)才.肌肽的生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,20(5)：75-77.

[9] 王愛紅,朱潔,劉翠梅,等.肌肽對(duì)局灶性腦缺血性疾病大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,34(10)：1333-1336.

[10] 王愛紅,朱潔,劉翠梅,等.肌肽對(duì)局灶性腦缺血性疾病大鼠外周血IFN-γ、IL-4的影響[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,34(9)：1179-1183.

[11] 隋鑫，陳曉輝，房麗娜，等.新藥L-肌肽的波譜學(xué)數(shù)據(jù)與結(jié)構(gòu)確證[J].今日藥學(xué),2009,19(9):29-31.

[12] Nakase T,Yoshioka S,Suzuki A,et al.Free radical scavenger,edaravone,reduces the lesion size of lacunar infarction in human brain ischemic stroke[J].BMC Neurol,2011,79(11):39.

[13] Stvolinsky S,Kukley M,Dobrota D,et al.Carnosine protects rats under global ischemia[J].Brain Res Bull,2000,53(4):445-448.

[14] 申峰,周宏博,劉明,等.肌肽對(duì)大鼠腦缺血性疾病再灌注損傷的保護(hù)作用[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2003,23(2)：221-222.

[15] 王富明,張亞敏,孫華,等.針刺對(duì)大鼠腦缺血性疾病再灌注損傷后不同時(shí)點(diǎn)血清SOD和MDA表達(dá)的影響[J].針灸臨床雜志,2015,31(2)：62-65.

[16] 唐巧,歐冊(cè)華.缺血后處理腦保護(hù)作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年保健醫(yī)學(xué),2011,9(2)：56-58.

[17] 侯傳記,馬春,周強(qiáng),等.肌肽在腦缺血性疾病再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2001,4(21)：281-283.

[18] 陳秀蓮,孫林,于培蘭,等.熱休克蛋白70與缺血性腦損傷[J].中國(guó)臨床康復(fù),2006,10(24)：137-139.

[19] Denes A,Thornton P,Rothwell NJ,et al.Inflammation and brain injury: acute cerebral ischemia,peripheral and central inflammation[J].Brain Behav Immun,2010,24(5):708-723.

[20] 樊鴻浩,李茹冰.腦缺血性疾病再灌注的相關(guān)細(xì)胞通路調(diào)節(jié)研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2015,29(2)：310-316.

[21] Ramos-Fernandez M,Bellolio MF,Stead LG,et al.Matrix metalloproteinase-9 as a marker for acute ischemic stroke: a systemic review[J].J Stroke Cerebrorasc Dis,2011,20(1):47-54.

[22] Hangen E,Blomgren K,Benit P,et al.Life with or without AIF[J].Trends Biochem Sci,2010,35(5):278-287.

[23] Liesz A,Suri-Payer E,Veltkamp C,et al.Regulatory T cells are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke[J].Nat Med,2009,15(2):192-199.

[24] 尤建良,龔時(shí)夏,周留勇.中藥微調(diào)三號(hào)方配合化療治療中晚期大腸癌30例[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,26(4)：259-261.

[25] 朱為民,肖寒,方乃青,等.加減沙參麥冬湯聯(lián)合化療對(duì)肺癌患者免疫功能的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,27(6)：523-526.

[26] Gao J,Duan B,Wang DG,et al.Coupling between NMDA receptor and acid-sensing ion channel contributes to ischemic neuronal death[J].Neuron,2005,48(4):635-646.

[27] 沈耀，胡薇薇，陳忠.肌肽和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,36(2):199-203.

教育部人文社項(xiàng)目基金立項(xiàng)(1318)。

王愛紅(E-mail: 370010@njucm.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.037

R743

A

1002-266X(2016)27-0104-03

2015-12-01)