鐘靜，劉杉，楊應(yīng)，魏晶，黃晶晶，熊校勤

(湖北第二師范學(xué)院植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430205)

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小檗堿對人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

鐘靜，劉杉，楊應(yīng)，魏晶，黃晶晶，熊校勤

(湖北第二師范學(xué)院植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430205)

目的觀察小檗堿對人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3增殖、凋亡的影響，并探討其可能作用機(jī)制。方法取對數(shù)生長期PC3細(xì)胞分為A、B、C、D、E組，分別加入終濃度為10、25、50、75、100 μmol/L小檗堿培養(yǎng)，對照組只加ddH2O。觀察培養(yǎng)24、48 h時各組細(xì)胞增殖情況。另取培養(yǎng)48 h時PC3細(xì)胞(觀察組)，加入終濃度為 75 μmol/L小檗堿培養(yǎng)，對照組只加細(xì)胞培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞凋亡情況，檢測剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-Caspase-3)、B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)。結(jié)果隨濃度升高，A、B、C、D、E組細(xì)胞增殖抑制率增加，P均<0.05；隨培養(yǎng)時間增加，A、B、C、D、E組細(xì)胞增殖抑制率增加，P均<0.05。培養(yǎng)48 h時觀察組及對照組細(xì)胞凋亡率分別為74.43%±5.69%、2.51%±0.86%，觀察組細(xì)胞凋亡率與對照組比較明顯升高(P<0.05)。培養(yǎng)48 h時觀察組細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白的相對表達(dá)量分別為0.30±0.02、0.56±0.03、0.37±0.03、0.10±0.01,對照組分別為0.15±0.04、0.41±0.03、0.58±0.04、0.11±0.02。與對照組相比，觀察組細(xì)胞Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白的相對表達(dá)量均升高，Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量降低(P均<0.05)，而LC3蛋白的相對表達(dá)量無明顯變化。 結(jié)論小檗堿可抑制PC3細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與小檗堿可上調(diào)Cleaved-Caspase-3、Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

小檗堿；前列腺癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；自噬

前列腺癌是中、老年男性常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。其發(fā)病率和病死率分別居全球男性癌癥的第2位和第6位，且呈逐年遞增趨勢[2]。前列腺癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，既往研究[3]認(rèn)為細(xì)胞增殖和凋亡的失衡是其發(fā)生、發(fā)展的重要因素。凋亡和自噬是細(xì)胞死亡的兩種形式。兩者機(jī)制不同，但是存在復(fù)雜的交互調(diào)控作用。B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，前者具有抑制凋亡作用，而后者具有促進(jìn)凋亡作用[4]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)在細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行分子，參與許多凋亡信號傳導(dǎo)途徑[5,6]。而微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)則是重要的檢測自噬體形成的特異性標(biāo)記蛋白[7,8]。小檗堿是一種喹啉生物堿，主要存在于毛莨科、蕓香科和小檗科等植物中[9]；因具有清熱解毒和抗菌消炎的功效，傳統(tǒng)中醫(yī)中長期用于治療細(xì)菌導(dǎo)致的胃腸道疾病[10,11]。最新研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可提高糖尿病患者的胰島素抵抗、改善高血脂[12,13]。同時其抗腫瘤活性較高，但其抗腫瘤的具體作用機(jī)制及其通道尚未完全闡明[14～16]。2014年4月～2015年12月，我們觀察了小檗堿對人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3增殖及凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、藥物、儀器及試劑PC3細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，0.25%胰蛋白酶消化傳代。小檗堿、MTT購自Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購于Gibco公司,細(xì)胞裂解液來自碧云天生物技術(shù)研究所,GAPDH、Bcl-2、Bax、剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-Caspase-3)、LC3抗體購自CST公司。蛋白電泳儀和半干轉(zhuǎn)膜儀購自Bio-RAD公司。

1.2小檗堿對PC3細(xì)胞增殖的影響觀察采用MTT法。取對數(shù)生長期PC3細(xì)胞，3×103/孔接種于96孔板，分為A、B、C、D、E組，分別加入終濃度為10、25、50、75、100 μmol/L小檗堿培養(yǎng)，對照組只加ddH2O。分別于培養(yǎng)24、48 h時取各組細(xì)胞，加入5 mg/mL MTT 10 μL，孵育4 h，離心后取上清，加入150 μL DMSO，輕微振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解，采用酶標(biāo)儀檢測各組在570 nm 波長處的吸光度(A)，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對照組)×100%。重復(fù)3次，取平均值。

1.3小檗堿對PC3細(xì)胞凋亡的影響觀察及細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3檢測①小檗堿對PC3細(xì)胞凋亡的影響觀察：采用流式細(xì)胞儀。取對數(shù)生長期觀察組細(xì)胞，1×106/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，加入終濃度為75 μmol/L的小檗堿培養(yǎng)，每組5個復(fù)孔，對照組只加培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。各取100 μL兩組細(xì)胞懸液，加入5 μL Alexa Fluor@488 annexin V和100 μg/mL PI 1 μL，混勻后室溫避光孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀檢測兩組培養(yǎng)48 h時細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。②細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白檢測：采用Western blotting法。培養(yǎng)48 h時取兩組對數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶消化，PBS洗兩次，加入150 μL細(xì)胞裂解液混勻，冰上放置30 min使細(xì)胞充分裂解，獲取上清液。BCA法提取總蛋白，取30 μg總蛋白，12% SDS-PAGE電泳90 min，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜40 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜，加入兔抗大鼠Bax和Bcl-2一抗(1∶1 000)、兔抗大鼠Cleaved-Caspase-3一抗(1∶500)、兔抗大鼠LC3一抗(1∶500)4 ℃過夜。TBST洗膜4次，每次5 min；加入山羊抗兔Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3和LC3二抗(1∶2 000)封閉1 h，顯色曝光。以GAPDH作為內(nèi)參，用Image J軟件進(jìn)行灰度掃描進(jìn)行定量分析。以目的蛋白與GAPDH灰度值之比作為Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2　結(jié)果

2.1不同時間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖抑制率比較培養(yǎng)24 h時A、B、C、D、E組的細(xì)胞增殖抑制率分別為0.69%±0.22%、14.19%±1.38%、32.15%±2.63%、38.87%±1.09%、44.27%±1.95%，隨濃度升高，A、B、C、D、E組細(xì)胞增殖抑制率增加，P均<0.05。培養(yǎng)48 h時A、B、C、D、E組的細(xì)胞增殖抑制率分別為6.60%±3.80%、20.23%±7.62%、38.12%±1.66%、46.35%±1.56%、63.36%±2.06%，隨培養(yǎng)時間增加，A、B、C、D、E組細(xì)胞增殖抑制率增加，P均<0.05。

2.2兩組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白比較培養(yǎng)48 h時觀察組及對照組細(xì)胞凋亡率分別為74.43%±5.69%、2.51%±0.86%，觀察組細(xì)胞凋亡率高于對照組(P<0.05)。培養(yǎng)48 h時觀察組細(xì)胞Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3蛋白的相對表達(dá)量分別為0.30±0.02、0.56±0.03、0.37±0.03、0.10±0.01,對照組分別為0.15±0.04、0.41±0.03、0.58±0.04、0.11±0.02，與對照組相比，觀察組組細(xì)胞Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白的相對表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量減低，而LC3蛋白的相對表達(dá)量無明顯變化(P均<0.05)。

3　討論

前列腺癌是發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，其發(fā)生與多種因素有關(guān)。在直系男性親屬患前列腺癌的家族中，其男性發(fā)病率明顯增高。雄激素可以促進(jìn)前列腺癌的生長，體內(nèi)雄激素水平較高可能也是前列腺癌的誘因之一。此外，高動物脂肪飲食也與前列腺癌的發(fā)生有一定關(guān)系[1]。對前列腺癌的治療方法包括放射性粒子植入、根治性前列腺切除術(shù)、根治性外放射治療、內(nèi)分泌治療和免疫治療等[2]。目前在癌癥治療中普遍采用的藥物在殺死癌細(xì)胞的同時也會對人體正常細(xì)胞產(chǎn)生較大毒副作用。因此，療效好且毒性低的抗癌藥物研究一直是癌癥治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和重要課題。其中，植物來源抗癌藥物的研究和開發(fā)是其重要組成部分。

以往我國臨床常用小檗堿治療胃腸道感染，近年研究[9,10，12，13]表明小檗堿能通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)、加強(qiáng)腸道黏膜屏障和改善局部的慢性炎癥從而起到抗代謝紊亂的作用。此外小檗堿在腸道腫瘤防治中也表現(xiàn)出良好的效果。例如小檗堿可以減少宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和血管生成[14]。在肝癌細(xì)胞中，小檗堿能夠通過下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子，從而抑制癌細(xì)胞血管生成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。小檗堿可通過引起結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯在G2/M期并誘導(dǎo)p21，從而引起細(xì)胞凋亡[16]。盡管目前對小檗堿抗癌的作用機(jī)制已經(jīng)有了一定的研究，但是其具體途徑和機(jī)制尚未完全明確，尤其小檗堿在發(fā)揮抗癌作用中是否涉及細(xì)胞自噬過程并不清楚。因此，本研究觀察研究了不同濃度小檗堿對PC3前列腺癌細(xì)胞增殖的影響和可能機(jī)制。結(jié)果顯示，小檗堿對PC3前列腺癌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且這種抑制作用具有濃度和時間依賴效應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種形式[17]。Bcl-2家族在線粒體依賴的細(xì)胞凋亡途徑中起著重要的調(diào)控作用。該家族成員包括Bcl-2/Bax、Bcl-xl/Bcl-xs和Bak等，其中Bcl-2/Bax的作用尤為關(guān)鍵[4]。Bcl-2是一種抑制凋亡蛋白。Bcl-2可與Bax形成異源二聚體使其失活，并改變線粒體膜的通透性，促使細(xì)胞色素C的釋放。細(xì)胞色素C與Apaf-l和Caspase-9形成復(fù)合體，激活凋亡效應(yīng)分子Caspase-3，最終引起細(xì)胞凋亡[5,6]。本研究結(jié)果顯示用75 μmol/L小檗堿處理PC3細(xì)胞48 h能夠引起PC3細(xì)胞產(chǎn)生顯著的凋亡現(xiàn)象。進(jìn)一步的研究顯示，處理細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平明顯下降，而Bax和Cleaved-Caspase-3表達(dá)量則明顯上調(diào)。這可能是由于小檗堿處理?xiàng)l件下，由于Bcl-2的下調(diào)和Bax的上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Bax/Bax同源二聚體增多。進(jìn)而調(diào)控線粒體PT孔的開放，釋放出細(xì)胞色素C。細(xì)胞色素C、Apaf-l和Caspase-9復(fù)合體剪切Caspase-3前體形成具有活性的Cleaved-Caspase-3，從而激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

目前研究認(rèn)為，自噬是區(qū)別于凋亡的另一條細(xì)胞死亡途徑。自噬和凋亡二者通路相互關(guān)聯(lián)，互為調(diào)控[18]。Bcl-2家族蛋白除參與到細(xì)胞凋亡之外還可對細(xì)胞自噬過程產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。Beclin1參與了自噬體的形成和成熟。Bcl-2能與Beclin1結(jié)合，從而抑制自噬的發(fā)生[19]。LC3是評價自噬活性的重要標(biāo)記分子，包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式。當(dāng)形成自噬體時，LC3-Ⅰ與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ。直到自噬體與溶酶體結(jié)合后，LC3-Ⅱ才被其中的水解酶降解[7,8]。為了解本研究中Bcl-2表達(dá)量的下降是否會引起細(xì)胞自噬，因此進(jìn)一步檢測了LC3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在用小檗堿處理PC3細(xì)胞后，細(xì)胞中LC3表達(dá)量并無明顯變化，這表明小檗堿處理并沒有促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成。這可能是由于盡管細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)水平有所下降，釋放出Beclin1。但是由于Caspase-3的激活，能夠剪切Beclin1從而抑制自噬的發(fā)生，因此無法促進(jìn)自噬體的形成。

綜上所述，小檗堿能夠明顯抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖。其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax和Cleaved-Caspase-3的表達(dá)，從而激活線粒體依賴的細(xì)胞凋亡途徑。并且其中可能并不涉及自噬途徑。

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Trans助研夢想基金項(xiàng)目(Trans-RasDF-019)。

熊校勤(E-mail：jjing2003_1@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.013

R737.25

A

1002-266X(2016)27-0041-03

2016-02-19)