王建飛，曹若瓊，孫陽陽，邱宇，王君，鐘理,3

(1河北大學生命科學學院，河北保定 071002；2保定市第一中心醫(yī)院；3 Western University of Health Science)

?

糖尿病患者外周血白細胞端粒酶活性變化及其影響因素分析

王建飛1，曹若瓊1，孫陽陽1，邱宇1，王君2，鐘理1,3

(1河北大學生命科學學院，河北保定 071002；2保定市第一中心醫(yī)院；3 Western University of Health Science)

目的觀察糖尿病患者白細胞端粒酶活性變化，并分析外周血白細胞端粒酶活性的影響因素。方法以1型糖尿病(T1DM)患者40例為A組，2型糖尿病(T2DM)患者80例為B組，健康體檢者50例為對照組。抽取各組外周靜脈血5 mL，離心后提取白細胞，采用熒光定量PCR法檢測各組白細胞中端粒酶活性。采用多元線性回歸分析法分析T2DM患者白細胞中端粒酶活性的影響因素。結果A、B、C組外周血白細胞端粒酶活性(Ct值)分別為31.64±1.03、32.22±0.75、33.19±0.95，組間兩兩比較，P均<0.05。性別、吸煙狀況與T2DM患者外周血白細胞端粒酶活性有關(P均<0.05)。結論糖尿病患者外周血白細胞端粒酶活性升高，且T1DM患者白細胞端粒酶升高更明顯。性別、吸煙狀況是T2DM患者外周血白細胞端粒酶活性的影響因素。

端粒酶；端粒酶活性；白細胞；糖尿??；1型糖尿??；2型糖尿病

端粒是真核細胞染色體末端的一段特殊DNA結構，可保護染色體末端免于降解，維持細胞活性。端?？s短常被臨床用作細胞凋亡的生物學標志[1]。端粒酶是一種核糖核酸蛋白質復合體，由具有逆轉錄活性的端粒酶逆轉錄酶(TERT)、端粒酶RNA基因(TERC)、端粒重復序列結合因子(TRF)三個亞基構成[2]。既往研究[3,4]發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者由于自身免疫作用或氧化應激反應會導致外周血白細胞端粒存在非正常長度縮短現(xiàn)象，檢測糖尿病患者外周血白細胞的端粒酶活性可能成為糖尿病的重要分子指標。2014年10月～2015年12月，本研究觀察了糖尿病患者的外周血端粒酶活性變化，并分析其影響因素?，F(xiàn)將結果報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2014年10月～2015年12月我院收治的120例糖尿病患者，其中男63例、女57例，年齡23～78歲；均符合《內(nèi)科學(第7版)》提出的T1DM的診斷標準[5]；無大血管、腎臟病變等并發(fā)癥。120例糖尿病患者分為T1DM患者40例(A組)和T2DM患者80例(B組)。B組中男43例、女37例，年齡(55.71±10.61)歲，BMI(27.21±2.94)kg/m2，患病時間(7.39±7.12)年，其中吸煙24例、不吸煙56例；A組中男20例、女20例，年齡(43.50±13.19)歲，BMI(25.26±7.40)kg/m2，患病時間(6.33±4.85)年，其中吸煙13例、不吸煙27例。對照組為同期50例健康成年人，其中男23例、女27例，年齡23～78(46.11±15.85)歲，BMI(25.16±3.40)kg/m2，其中吸煙16例、不吸煙34例。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，三組均知情同意并簽署知情同意書。

1.2各組外周血白細胞端粒酶活性檢測①外周血白細胞獲?。撼槿「鹘M靜脈血5 mL，2 500 r/min離心30 min，提取分層中的白細胞，將提取白細胞用PBS 清洗兩遍，在顯微鏡下利用細胞計數(shù)板計算單位體積白細胞數(shù)。取1×106個細胞，加入200 μL Lysis buffer(凱基生物公司，中國南京)，震蕩混勻，冰浴30 min。4 ℃、13 000 r/min離心30 min，取上清，液氮急速冷凍后-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。②白細胞中端粒酶活性檢測：采用熒光定量PCR法檢測各組外周血白細胞與血漿中的端粒酶活性[6,7]，所有操作均嚴格按照使用說明書進行。端粒酶相關引物 ACX：5′-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3′ ；TS：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′，引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。反應體系(20 μL)：2x SYBR q-PCR Master Mix 10 μL、上游引物TS 1 μL、下游引物ACX 0.5 μL、端粒酶樣品5 μL、RNase free water 3.5 μL。反應條件：25 ℃孵育30 min，95 ℃滅活端粒酶5 min，40個循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s；熔解曲線設定為65 ℃、95 ℃。采用CFX96 熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國)觀察各組白細胞與血漿中Ct值。以Ct值表示端粒酶活性強弱，Ct值大說明端粒酶活性低；Ct值小說明端粒酶活性高。實驗重復3次，取平均值。

2　結果

2.1各組白細胞中端粒酶活性A、B、C組外周血白細胞端粒酶活性分別為31.64±1.03、32.22±0.75、33.19±0.95，組間兩兩比較，P均<0.05。

2.2T1DM患者外周血白細胞端粒酶活性影響因素在三組樣本的基本資料對比中，年齡與BMI差異性顯著(P均<0.05)；性別、患病時間與吸煙情況沒有顯著性差異(P均>0.05)。 糖尿病多元線性回歸分析顯示，A組性別、年齡、BMI、患病時間與吸煙情況與外周血白細胞的端粒酶活性均無關(P均>0.05)，見表1。B組年齡、BMI、患病時間與外周血白細胞端粒酶活性均無關(P均>0.05)；B組性別與吸煙情況與端粒酶活性呈負相關(β=-1.022、-0.714；P均<0.05)，見表2。

表1　T1DM患者外周血白細胞端粒酶活性影響因素的多元線性回歸分析結果

表2　T2DM患者外周血白細胞端粒酶活性影響因素的多元線性回歸分析結果

3　討論

超過90%人類腫瘤組織中均能發(fā)現(xiàn)端粒酶活性，而且活性異常，是比較廣譜的腫瘤標志物之一，但在大多數(shù)正常組織和細胞中并沒有發(fā)現(xiàn)端粒酶活性[8,9]。研究發(fā)現(xiàn)白細胞中也存在端粒酶活性[10]，而且在很多疾病中也發(fā)現(xiàn)了外周血白細胞的端粒酶活性異常現(xiàn)象，例如白血病、類風濕關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[11]等。許多疾病的體液中也能檢測出端粒酶活性，例如膀胱癌患者的尿液中[12]、肺癌患者的支氣管洗液等；并且惡性腫瘤患者的血漿中通?？梢詸z測出端粒酶活性，是由于腫瘤細胞破裂所致，而血漿端粒酶活性也成為惡性腫瘤檢測的重要標志物之一。端粒酶活性與端粒長度是密切相關的，二者共同作用與人類身體健康與衰老密切相關。

外周血白細胞端粒酶活性檢測的試驗中發(fā)現(xiàn)，T1DM患者的端粒酶活性要強于T2DM患者，并且二者的白細胞端粒酶活性都強于健康志愿者[15]。表明糖尿病與外周血白細胞的端粒酶活性密切相關，一些研究也發(fā)現(xiàn)在缺乏端粒酶的成年小鼠中，會出現(xiàn)血糖耐受量異常的現(xiàn)象。糖尿病患者端粒酶活性異常的作用機制的說法有：氧化應激反應產(chǎn)生的反應性氧族會對DNA造成嚴重損害，并主要破壞線粒體DNA而產(chǎn)生更多的氧族，從而破壞細胞功能導致端粒酶活性異常；或者糖尿病影響并提高患者外周血白細胞端粒酶活性是為抑制高血糖所致的細胞凋亡[6]。而且T1DM對端粒酶活性的影響更大，T1DM是一種建立在遺傳基礎之上并與T細胞相關聯(lián)的自身免疫性疾病，自身T淋巴細胞對胰島素多種抗原成分出現(xiàn)免疫不耐受，導致T淋巴細胞會攻擊胰島β細胞使其大量凋亡最終導致糖尿病的出現(xiàn)，并且與胰島細胞相關聯(lián)的淋巴細胞也會出現(xiàn)異常凋亡現(xiàn)象[13]。T1DM外周血免疫細胞的異常凋亡與端粒長度的減短可能導致了細胞內(nèi)的端粒酶活性的異常。T2DM與T1DM的發(fā)病機制完全不同，T2DM是由于胰島素缺乏或者胰島素抵抗而產(chǎn)生的一種代謝性疾病，而長期的代謝紊亂可以導致端粒酶活性的異常，胰島素抵抗也會增加氧化應激程度導致端粒酶活性的異常出現(xiàn)[14]。推測其原因可能是由于T1DM對人體細胞的破壞程度更大，氧化應激反應與自身免疫反應將會嚴重影響細胞的端粒酶活性，因此，T1DM患者的端粒酶活性高于T2DM患者；以后還要加大試驗量并積極探究影響糖尿病患者端粒酶異常機制。

在T2DM 患者中男性與吸煙患者的外周血白細胞端粒酶活性高于女性與不吸煙者，這可能與男性的不良生活習慣有關，吸煙、喝酒、熬夜、高脂肪攝入等不良的生活習慣會導致機體的代謝紊亂繼而影響端粒酶活性；隨著年齡的增長，細胞老化、端粒長度減短而細胞進入程序性死亡過程，一般不會引起端粒酶的變化，肥胖是導致糖尿病產(chǎn)生的主要原因，而肥胖也會加重氧化應激反應的程度，BMI的增加會加重糖尿病的病情，對于此次試驗的結果在今后的研究中應加大BMI的選擇范圍與樣本量，探究BMI是否對細胞端粒酶活性有影響。

綜上所述，糖尿病患者存在外周血白細胞端粒酶活性升高，且T1DM患者外周血白細胞端粒酶升高更明顯。糖尿病患者外周血血漿中未見端粒酶活性。性別、吸煙狀況是T2DM患者外周血白細胞端粒酶活性的影響因素。

[1] Zakian VA.Structure,function,and replication of Saccharomyces cerevisiae teleromes [J].Annu Rev Genet,1996,30(1):141-172.

[2] Shay JW,Wright WE.Hallmarks of telomeres in ageing research [J].J Pathol,2007,211(2):114-123.

[3] Fyhrquist F,Tiitu A,Saijonmaa O,et al.Telomere length and progression of diabetic nephropathy in patients with type 1 diabetes [J].J Intern Med,2010,267(3):278-286.

[4] Liu ZL,Zhang JH,Yan JT,et al.Leucocyte telomere shortening in relation to newly diagnosed type 2 diabetic patients with depression [J].Oxid Med Cell Longev,2014,2014:1-8.

[5] 程樺.糖尿病[M].7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:365-371.

[6] 蔣玉艷,何敏,楊莉,等.熒光定量PCR法檢測腫瘤細胞端粒酶活性的變化[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2006,6(7):12-16.

[7] Wege H,Chui MS,Le HT,et al.SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity [J].Nucleic Acids Res,2003,31(2):E3.

[8] 劉瑩,董成永,崔曉楠.人端粒酶逆轉錄酶腫瘤相關反饋調節(jié)機制的研究進展[J].大連醫(yī)科大學學報,2015,37(6):605-609.

[9] Chen W,Chen SM,Yu Y,et al.Telomerase inhibition alters telomere maintenance mechanisms in laryngeal squamous carcinoma cells [J].J Laryngol Otol,2010,124(7):780-783.

[10] Hiyama K,Hirai Y,Kyoizumi S,et al.Activation of telomerase in human lymphocytes and hematopoictic progenitor cells [J].J Immunol,1995,155(8):3711.

[11] Kurosaka D,Yasuda J,Yoshida K,et al.Abnormal telomerase activity and telomere length in T and B cells from patients with systemic lupus erythematosus [J].J Rheumatol,2006,33(6):1102-1107．

[12] Stewart SA,Ben Porath I,Carey VJ,et al.Erosion of the telomeric single-strand overhang at replicative senescence [J].Nature Genet,2003,33(4): 493-496.

[13] 魯燕,陸軼群,程緒杰,等.1型糖尿病患者外周血白細胞端粒長度的變化及其意義[J].江蘇醫(yī)藥,2007,33(2):127-128.

[14] Qinan W,Ling Z,Bing C.The influence of the telomere-telomerase system on diabetes mellitus and its vascular complications [J].Expert Opin Ther Targets,2015,9(6):849-864.

國家自然科學基金資助項目(81472744,81272444)。

鐘理(E-mail：lee_z@yahoo.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.030

R587.1;R363.2

B

1002-266X(2016)27-0085-03

2016-01-28)