付　瑩　王添敏　邸　學(xué)　張　慧　初正云　翟延君

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧　大連　116600

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與胡桃楸莖枝同煮雞蛋中吸收成分的提取工藝研究

付瑩王添敏*邸學(xué)張慧初正云翟延君*

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600

【摘要】目的：研究胡桃楸莖枝含藥雞蛋中吸收成分的提取工藝，為胡桃楸的抗腫瘤有效成分研究奠定基礎(chǔ)。方法：采用不同溶劑提取胡桃楸莖枝的含藥雞蛋提取液作為供試品溶液，以供試品溶液中HPLC峰個數(shù)及峰面積總和為評價指標。通過單因素試驗對提取溶劑中加酸量、提取方法和提取溶劑種類進行選擇，通過正交試驗對提取溶劑的濃度、提取溶劑的用量和提取時間進行優(yōu)化。結(jié)果：通過單因素試驗確定提取溶劑中不加酸，采用回流提取，提取溶劑為含水丙酮；正交試驗確定最佳提取工藝為：50倍量50%丙酮回流提取2h。結(jié)論：優(yōu)選后的提取工藝穩(wěn)定可靠、合理可行，為研究胡桃楸含藥雞蛋中吸收的成分奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】胡桃楸；莖枝；含藥雞蛋；提取工藝；正交設(shè)計

胡桃楸始載于《開寶本草》，具有補肺益腎、滋陰助陽、抗癌的功效[1]。民間將胡桃楸與雞蛋同煮用于治療腫瘤[2]，輕者吃雞蛋，重者蛋湯同吃。本課題組前期對與胡桃楸不同部位同煮的雞蛋(含藥雞蛋)進行抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)與胡桃楸不同部位同煮的含藥雞蛋均有不同程度的抗腫瘤作用，其中，莖枝的含藥雞蛋抗腫瘤作用最明顯。但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)提取含藥雞蛋吸收成分的研究報道。另外，含藥雞蛋中吸收的成分較多，不能以單一成分或某類成分的含量為考察指標，為了全面準確的分析含藥雞蛋中吸收的成分，研究以HPLC圖譜中峰個數(shù)及峰面積總和為指標，采用單因素試驗和正交試驗相結(jié)合，對與胡桃楸莖枝同煮的雞蛋中吸收成分的提取工藝進行了優(yōu)化，為深入研究胡桃楸含藥雞蛋的抗腫瘤作用及胡桃楸的合理開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1儀器與材料

1.1儀器Agilent 1260高效液相色譜儀(G1242B型DAD檢測器，美國Agilent公司)；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ALC-110.4萬分之一電子天平(賽多利斯)；JA21002電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；QF-3800氮氣吹干儀(天津市旗美科技有限公司)。

1.2材料胡桃楸莖枝樣品于2012年10月采自遼寧省普蘭店市蓮山鎮(zhèn)老白山，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為胡桃楸科植物胡桃楸JuglansmandshuricaMaxim.；市售新鮮雞蛋；乙腈(美國霍尼韋爾公司)、三氟乙酸(TFA，百靈威科技有限公司)、甲醇(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)均為色譜純；娃哈哈純凈水(杭州哇哈哈純凈水有限公司)，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫為30℃；流速1ml/min；檢測波長為270nm；進樣體積20μl或50μl(根據(jù)樣品濃度改變)；流動相為0.1%TFA-乙腈和0.1%TFA-水溶液，梯度洗脫程序見表1。

查算供試品溶液的HPLC圖譜中色譜峰個數(shù)和峰面積總和采用的積分事件參數(shù)：斜靈敏度為0.5，峰寬為0.02，最小峰面積為0.5，最小峰高為0.1。峰個數(shù)和峰面積總和均除去溶劑峰后進行查算。

表1　流動相梯度洗脫程序

2.2含藥雞蛋的制備取雞蛋數(shù)枚，稱重，加入與雞蛋等重的胡桃楸莖枝粉末(過40目篩)，10倍量水煎煮。雞蛋蛋白稍凝固后，將蛋殼敲碎繼續(xù)煮4h。取出雞蛋，去殼，置攪拌器中加入適量水攪勻，混懸液經(jīng)冷凍干燥得與胡桃楸莖枝同煮的雞蛋(含藥雞蛋)粉末。

2.3供試品溶液的制備取胡桃楸莖枝含藥雞蛋粉末0.5g，精密稱定，置50ml圓底燒瓶中，按照單因素和正交設(shè)計實驗，加入不同體積、不同濃度的丙酮或乙醇溶液，回流提取2~4h或超聲提取1h，提取結(jié)束后，濾過，取續(xù)濾液5ml，吹干，精密加入10%甲醇1ml溶解殘渣，混勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4單因素試驗

2.4.1提取溶劑中加酸量考察以25ml體積分數(shù)為70%的丙酮作為提取溶劑，分別加入體積分數(shù)為0、1%、2%、3%的甲酸，按“2.3”項下回流提取2h方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行HPLC分析，考察提取溶劑中加入一定量的酸對供試品溶液中HPLC峰個數(shù)及峰面積總和的影響。結(jié)果(表2)表明，提取溶劑中不加酸時，供試品溶液中HPLC峰的個數(shù)為108個，明顯高于其它各加酸組；峰面積總和為3675，也高于其它各加酸組。因此選擇提取溶劑中不加酸進行下面提取方法的考察。

表2　提取溶劑中加入不同量甲酸供試品

2.4.2提取方法的考察以25ml濃度為70%的丙酮作為提取溶劑，分別采用回流提取2h、30℃超聲提取1h、40℃超聲提取1h和50℃超聲提取1h，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行HPLC分析，考察不同提取方法對供試品溶液中HPLC峰個數(shù)及峰面積總和的影響。結(jié)果(表3)表明，采用回流提取時，供試品溶液中HPLC色譜峰面積總和為4217.63，明顯高于其它超聲提取組；峰個數(shù)為97個，也高于其它各超聲提取組。因此選擇回流提取方法進行下面提取溶劑的考察。

表3　不同提取方法對供試品溶液中HPLC

2.4.3提取溶劑種類的考察分別以25ml濃度為50%、70%、90%的丙酮溶液和25ml濃度為50%、70%、90%的乙醇溶液作為提取溶劑，按“2.3”項下回流提取2h方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行HPLC分析，考察不同提取溶劑對供試品溶液中HPLC峰個數(shù)及峰面積總和的影響。結(jié)果見圖1，隨著丙酮和乙醇濃度的升高，供試品溶液中HPLC峰的個數(shù)及峰面積總和均減小，50%丙酮提取效率優(yōu)于70%丙酮和90%丙酮的提取效率，50%乙醇提取效率優(yōu)于70%乙醇和90%乙醇的提取效率。比較乙醇和丙酮2種提取溶劑，50%乙醇提取的供試品溶液中HPLC峰個數(shù)(127個)略高于50%丙酮提取的供試品溶液中HPLC峰個數(shù)(125個)，但兩者間無明顯差異；而50%、70%、90%丙酮提取的供試品溶液中HPLC峰面積總和均高于相應(yīng)50%、70%、90%乙醇提取的峰面積總和，其中50%丙酮提取的供試品溶液中HPLC峰面積總和最高，為6364.26。因此選擇丙酮作為提取溶劑進行下面提取溶劑濃度的考察。2.4.4提取溶劑濃度的考察在提取溶劑種類考察的實驗中發(fā)現(xiàn)，制備供試品溶液時，隨著丙酮和乙醇濃度的降低，濾過的速度明顯減慢，此過程增加了提取溶劑的揮發(fā)，在一定程度上使續(xù)濾液濃度增大，導(dǎo)致低濃度溶劑提取時供試品溶液中HPLC峰面積增大。同時，從圖1可知，在選取的丙酮3個濃度中，沒有找到提取效率最高的濃度點，仍需向低濃度方向擴大提取溶劑濃度考察的范圍。因此在以丙酮為提取溶劑進行溶劑濃度考察時，為了避免續(xù)濾液在濾過時濃度變大的影響，供試品溶液制備采用微孔濾膜濾過后直接進行HPLC分析，未進行濃縮，此次實驗的HPLC進樣濃度為其它實驗的1/2，所以峰面積總和也相應(yīng)減少；為了能夠包含提取效率最高的溶劑濃度點，選擇30%、50%、70%、90%的丙酮作為提取溶劑濃度考察的范圍。

分別以25ml的30%、50%、70%、90%的丙酮溶液作為提取溶劑，按“2.3”項下回流提取2h，提取結(jié)束后，上清液經(jīng)微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行HPLC分析。結(jié)果(圖2)表明不同濃度丙酮提取效率差異明顯，30%丙酮提取供試品溶液的HPLC峰個數(shù)(118個)略高于50%丙酮提取供試品溶液的HPLC峰個數(shù)(116個)，但兩者間無明顯差異；50%丙酮提取供試品溶液的HPLC峰面積總和為3193.51，明顯高于其它各濃度丙酮組。90%丙酮提取供試品溶液的HPLC峰個數(shù)及峰面積總和均為最低，提取效率最差，故選擇30%、50%、70%的丙酮溶液作為正交試驗考察的范圍。

2.5正交試驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取丙酮濃度(A)、溶劑用量(B)、提取時間(C)為考察因素，D列為空白列即誤差列，用來評估實驗的誤差。每個因素設(shè)定三個水平，采用L9(34)正交試驗設(shè)計表[3-4]，分析因素及水平見表4。正交設(shè)計方案及其結(jié)果見表5，根據(jù)每個實驗號的試驗條件，按“2.3”項下回流提取2h方法制備供試品溶液，實驗結(jié)果以供試品溶液中HPLC色譜峰的個數(shù)和峰面積總和為評價指標。

表4　正交試驗因素水平

表5　正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果

在對正交試驗結(jié)果進行直觀分析時，極差反映了A、B、C三個因素對實驗結(jié)果影響的程度。極差越大，說明該因素水平變動時，實驗結(jié)果的變化越大。從供試品溶液HPLC峰個數(shù)的極差值(表5)來看，實驗中各因素的影響順序依次為A(丙酮濃度)>C(提取時間)>B(溶劑用量)，但是差別較?。粡腍PLC峰面積總和的極差分析，各因素影響順序為A(丙酮濃度)>B(溶劑用量)>C(提取時間)，其中丙酮的濃度及用量對峰面積總和的影響相對較大，提取時間對峰面積的影響較小。從供試品溶液HPLC色譜峰個數(shù)的方差分析來看(表6)，丙酮的濃度、用量及提取時間的P值均大于0.3，說明各因素對色譜峰的個數(shù)均無顯著性影響。從供試品溶液HPLC色譜峰面積總和來看(表7)，丙酮濃度的P<0.05，說明丙酮濃度對峰面積總和有顯著性影響；提取溶劑用量的P值為0.061，說明溶劑用量對峰面積總和有一定的影響，但影響不顯著；而提取時間的P值為0.132，說明提取時間對峰面積總和無顯著性影響。

通過直觀分析和方差分析結(jié)果可知，提取溶劑濃度、用量和提取時間對供試品溶液中HPLC峰個數(shù)無顯著性影響。而提取溶劑的濃度和用量對供試品溶液的HPLC峰面積總和均有影響，且提取溶劑濃度的影響顯著。因此忽略峰個數(shù)指標，選擇色譜峰面積總和為指標，得到最佳提取工藝組合為A2B2C1，即采用50%丙酮為提取溶劑，溶劑用量為含藥雞蛋的50倍，回流提取2h。此提取工藝也符合實際生產(chǎn)中周期短、成本低等特點。

表6　以峰個數(shù)為指標的正交試驗方差分析結(jié)果

表7　以峰面積為指標的正交試驗方差分析結(jié)果

2.6提取工藝驗證為了確定提取工藝的穩(wěn)定性及可靠性，對以上所選的工藝條件進行3批驗證實驗，結(jié)果見表8，HPLC圖譜見圖3、4。結(jié)果表明，供試品溶液中HPLC色譜峰的個數(shù)及峰面積總和的RSD分別為1.79%、3.91%，說明該提取工藝結(jié)果穩(wěn)定。最佳提取工藝組合A2B2C1沒有出現(xiàn)在正交試驗設(shè)計表中，通過驗證實驗發(fā)現(xiàn)該提取條件下供試品溶液中HPLC色譜峰面積總和高于正交試驗設(shè)計表中所選的提取條件，而峰個數(shù)與正交試驗設(shè)計表中所選的提取條件無明顯差異，因此最終確定該工藝為最佳提取工藝。

表8　優(yōu)選提取工藝驗證

3討論

民間將胡桃楸與雞蛋同煮用于治療腫瘤，課題組前期研究表明與胡桃楸莖枝同煮的雞蛋對植于小鼠腋下的H22腫瘤生長具有較明顯的抑制作用參考文獻。為了明確胡桃楸含藥雞蛋中吸收的成分，本文從胡桃楸與雞蛋同煮的用法出發(fā)，對胡桃楸含藥雞蛋中吸收成分的提取工藝進行了研究。胡桃楸中含有鞣質(zhì)、萘醌、酚酸和二芳基庚烷等成分[5]，這些成分的結(jié)構(gòu)中都含酚羥基，尤其鞣質(zhì)類成分易與蛋白質(zhì)結(jié)合。部分成分與蛋白質(zhì)的結(jié)合在一定條件下是可逆的[6]，選擇合適的提取條件能夠?qū)⑦@些成分提取出來。提取溶劑的種類、pH值、用量以及提取方法、提取時間等均能影響雞蛋中吸收成分的提取率。因此本文考察了提取溶劑的種類、提取溶劑中加酸量、提取溶劑的濃度、提取溶劑的用量、提取方法和提取時間等6個因素對含藥雞蛋中吸收成分提取率的影響。由于考察因素較多，本文根據(jù)具體情況對因素進行了劃分，分為單因素試驗和正交試驗。

提取溶劑pH值主要通過影響成分的解離狀態(tài)以及破壞成分與蛋白質(zhì)間的結(jié)合力[7]來影響含藥雞蛋中吸收成分的提取率，該因素的影響結(jié)果在很大程度上不會受提取方法、提取溶劑和提取時間的影響。提取方法選擇回流提取和超聲提取，兩者對含藥雞蛋吸收成分提取率的影響取決于提取機制的不同[8]，受提取溶劑和提取時間的影響也較小。研究采用單因素試驗依次考察提取溶劑加酸量和提取方法對含藥雞蛋中吸收成分提取率的影響。由于胡桃楸中大部分成分的極性較大，提取溶劑比較了極性較大的含水丙酮和含水乙醇，結(jié)果各濃度丙酮對含藥雞蛋中吸收成分的提取率均高于相應(yīng)濃度乙醇組。因此選擇丙酮為提取溶劑，通過正交試驗對丙酮濃度、提取溶劑用量和提取時間進行了考察。

以供試品溶液中HPLC峰個數(shù)和峰面積和為指標，兩者之間有一定關(guān)聯(lián)又不完全相同。正交試驗的直觀分析和方差分析均表明各考察因素對供試品溶液中HPLC色譜峰個數(shù)的影響不顯著，對峰面積的影響顯著。因此以峰面積為指標確定了最佳提取工藝為：提取溶劑為50%丙酮溶液，溶劑用量為胡桃楸枝含藥雞蛋粉末的50倍，回流提取2 h。最后對優(yōu)選的最佳工藝進行驗證，表明該工藝方法簡單、提取率高、穩(wěn)定性好，為胡桃楸含藥雞蛋中吸收成分的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會．中國植物志(第21卷)[M]．北京：科學(xué)出版社，1982：33．

[2]賈敏如，李星煒．中國民族藥志藥[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005：354．

[3]武皓，鞏麗麗，楊勇，等．薏苡仁水溶性蛋白提取工藝的優(yōu)化[J]．中藥材，2015，38(2)：376-380．

[4]饒雙超，馮玲華，姜勝琴．丹歸通絡(luò)顆粒動態(tài)逆流提取工藝優(yōu)選[J]．中草藥，2015，38(3)：624-626．

[5]管小玉，曲中原，鄒翔，等．胡桃楸的化學(xué)成分研究進展[J]．中草藥，2009，40(增刊)：35-38．

[6]石碧，何先祺．水解類植物鞣質(zhì)性質(zhì)及其與蛋白質(zhì)反應(yīng)的研究[J]．皮革科學(xué)與工程，1993，3(2)：1-7．

[7]李樂，吳暉，賴富饒．不同提取pH條件下火麻仁蛋白組分的功能性質(zhì)研究[J]．2014，30(2)：16-19．

[8]鐘玲，尹蓉莉，張仲林．超聲提取技術(shù)在中藥提取中的研究進展[J]．西南軍醫(yī)，2007，9(6)84-87.

Optimization of the Extraction Technology of Drug-contained Eggs Cooked with Branches ofJuglansMandshurica

FU YingWANG TianminDI XueZHANG HuiCHU ZhengyunZHAI Yanjun

School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600, China

Abstract:Objective Eggs cooked with the branches of Juglans mandshurica which was called drug-contained eggs. For the research of constituents absorbed by the drug-contained eggs, this study was conducted to optimize the extraction technology of the drug-contained eggs.Methods For the optimization of acid content added into the extracting solvent, extracting method, and extracting solvent, single factor experiment was designed. Orthogonal experiment was conducted to choose the time of extraction, concentration and volume of the extracting solvent. The total number and the sum of area of chromatographic peak were taken as investigation index.Results The result of single factor experiment demonstrated that acetone and reflux was suitable for the extraction and no acid should be added into the extracting solvent. Orthogonal experiment suggested that the drug-contained eggs should be extracted with 50 times of 50% acetone by reflux for 2 hours. Conclusions The optimum extracting technology is reasonable and stable. This work was useful for the research of the constituents absorbed by the drug-contained eggs.

Key words:Juglans mandshurica;Branches;Drug-contained eggs;Extraction Technology;Orthogonal Design

(收稿日期：2015.12.20)

【中圖分類號】R284.2

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)04-0024-05

作者簡介：付瑩(1989-)，女，在讀碩士，主要從事中藥鑒定和質(zhì)量評價研究。E-mail：625315492@qq.com通信作者：翟延君，女，博士，教授，主要從事中藥品質(zhì)評價與鑒定方向研究。E-mail：lnzyzyj@sohu.com王添敏，女，博士，副教授，主要從事中藥品質(zhì)評價與鑒定方向研究。E-mail：wang_tm@163.com

基金項目：高等學(xué)校博士點專項基金新教師類(20102133120007)；遼寧省高等學(xué)校杰出青年學(xué)者成長計劃(LJQ2014099)。