駱詩露，黃健，韓道賓，朱杰華，陳澤慧，閔迅

(遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003)

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肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)疫苗研究進(jìn)展

駱詩露，黃健，韓道賓，朱杰華，陳澤慧，閔迅

(遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003)

摘要：隨著肺炎鏈球菌(SP)耐藥菌株的不斷出現(xiàn)使得疫苗研發(fā)備受關(guān)注，但目前使用的莢膜多糖及其結(jié)合疫苗有很大局限性。因此，針對SP主要毒力因子的蛋白質(zhì)疫苗迅速發(fā)展,其中SP單一蛋白質(zhì)疫苗包括溶血素、表面蛋白A、表面黏附素A、三組氨酸蛋白D、黏附毒力因子A，蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗包括多價重組蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗、多價蛋白質(zhì)融合疫苗，已取得一定實驗和臨床效果，有望替代多糖疫苗。

關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌；重組蛋白；聯(lián)合疫苗；融合疫苗

肺炎鏈球菌(SP)是一種重要的人類致病菌，主要引起細(xì)菌性肺炎、中耳炎、腦膜炎等疾病，2歲以下嬰幼兒和60歲以上老年人是其最主要的易感人群。隨著耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，通過接種疫苗已成為預(yù)防SP感染行之有效的手段。目前，市售的SP疫苗均基于其血清特異性莢膜多糖(CPS)設(shè)計，主要有多糖疫苗(PPV)、多糖結(jié)合疫苗(PCV)。PPV免疫原性較弱，對SP主要易感人群的保護(hù)性較差，對成人SP肺炎以及支氣管炎的作用很弱甚至沒有作用；PCV雖能有效保護(hù)主要易感人群，但存在覆蓋面窄(僅為歐美國家的常見血清型)、制備成本較高、使用過程中存在莢膜血清型轉(zhuǎn)換等缺點，嚴(yán)重限制了其在發(fā)展中國家的使用。因此，蛋白質(zhì)疫苗已成為近十年SP疫苗的研發(fā)主流。本文就SP單一蛋白質(zhì)疫苗及其聯(lián)合、融合蛋白疫苗的研究進(jìn)展綜述如下。

1SP單一蛋白質(zhì)疫苗

1.1SP溶血素(Ply)Ply是一種膽固醇依賴的造孔毒素，其具有直接的細(xì)胞毒性作用，能與宿主上皮細(xì)胞表面的膽固醇結(jié)合并插入到脂質(zhì)雙分子層中以形成寡聚孔，能引起細(xì)胞溶解并促進(jìn)細(xì)菌擴(kuò)散；此外，Ply還能通過與C1q、Fc段及CRP結(jié)合以激活補體經(jīng)典途徑，也能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1β，從而參與宿主的炎性反應(yīng)。因Ply在低濃度作用時的促炎效應(yīng)可導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷及細(xì)胞凋亡，所以當(dāng)前運用的疫苗主要是經(jīng)過化學(xué)減毒或無毒化處理后的衍生物，如第433位苯丙氨酸替換色氨酸的PdB及第146位丙氨酸缺失的ΔA146Ply。Knippenberg等[1]以PdB主動免疫小鼠后，可以阻斷Ply介導(dǎo)的肺纖維化效應(yīng)。在構(gòu)建的小鼠鼻黏膜免疫模型中，ΔA146Ply能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答，可抵抗不同型別SP引起的致死性感染[2]。此外，PlyD1無毒衍生物已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期安全性及人體免疫原性試驗，證實成人經(jīng)免疫后能產(chǎn)生大量的抗PlyD1的保護(hù)性抗體[3]。

1.2SP表面蛋白A(PspA)PspA是SP表面的膽堿結(jié)合蛋白，也是一種重要毒力因子。目前，已在其N端和脯氨酸富集區(qū)發(fā)現(xiàn)有B細(xì)胞抗原表位的存在。在小鼠系統(tǒng)性感染模型中，PspA可干擾C3b在SP表面沉積，阻止補體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用；并且在小鼠黏膜感染模型中，能夠保護(hù)SP免遭宿主乳鐵蛋白的攻擊[4～6]。此外，Roche等[7]構(gòu)建的Balb/c小鼠敗血癥模型中，經(jīng)皮下或腹腔途徑免疫全長的PspA，可以顯著提高小鼠的生存時間及生存率。Arulanandam等[8]構(gòu)建的小鼠鼻咽定植模型證實，經(jīng)鼻腔滴注全長的PsaA與IL-12可減少75%的鼻咽部SP定植量。在小鼠中耳炎模型中，PspA抗體同樣能夠提供有效的保護(hù)。

1.3SP表面黏附素A(PsaA)PsaA是一種分子量為37 kD的多功能脂蛋白，其在不同的血清型SP中具有較高的保守性，主要參與SP對Mn2+、Zn2+的轉(zhuǎn)運及對宿主上皮細(xì)胞的黏附效應(yīng)。有研究證實，與野生型TIGR4菌株相比，PsaA缺陷菌株能顯著降低其對鼻咽癌細(xì)胞的黏附能力及其對CBA/N小鼠的系統(tǒng)性感染能力[9]。PsaA與CT佐劑聯(lián)合經(jīng)鼻咽部免疫小鼠后，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生高滴度黏膜抗體IgA；而口服微粒體包裹的PsaA蛋白，血清中可產(chǎn)生高滴度的IgG和IgA抗體，從而抵抗不同血清型SP在肺部定植及敗血癥的形成。Oliveira等[10]將PsaA與乳酸桿菌活菌載體共同經(jīng)鼻腔免疫C57BL/6小鼠后，能夠同時誘導(dǎo)PsaA特異性的系統(tǒng)免疫抗體IgG和黏膜免疫抗體IgA的產(chǎn)生，從而抑制SP在鼻咽部定植。

1.4SP三組氨酸蛋白D(PhtD)PhtD是Pht家族中最保守的蛋白，能夠介導(dǎo)SP黏附宿主呼吸道上皮細(xì)胞及參與調(diào)節(jié)Zn2+的動態(tài)平衡；幫助逃避補體的免疫沉積，激發(fā)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[11，12]。在OF1雌性小鼠鼻咽部致死性攻擊模型中，經(jīng)肌肉接種PhtD蛋白后，能對不同血清型SP的致死性攻擊產(chǎn)生很好的保護(hù)效果，且健康人體內(nèi)獲得的抗PhtD血清也能給小鼠敗血癥模型中提供較高的被動保護(hù)效果[13]。此外，恒河猴經(jīng)肌肉接種PhtD蛋白后，能顯著提高其對19F型SP所致肺炎的抵抗力[14]。針對PhtD重組蛋白疫苗的Ⅰ期臨床試驗證實，健康成人免疫接種該蛋白后，能產(chǎn)生很好的體液免疫效果，且未產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)[15]。與傳統(tǒng)的鋁佐劑相比，PhtD與新型佐劑AS02V聯(lián)合使用后，能顯著促進(jìn)PhtD觸發(fā)的體內(nèi)CD4+T細(xì)胞及記憶性B細(xì)胞的產(chǎn)生，從而提升對老年人的免疫保護(hù)效果[16]。因此，PhtD成為當(dāng)前單個疫苗或聯(lián)合疫苗的首選。

1.5SP黏附毒力因子A(PavA)PavA為SP細(xì)胞壁外層的一種纖維連接蛋白結(jié)合蛋白，在細(xì)菌早期黏附及侵襲過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。與D39ΔPavA缺陷菌株相比，野生型菌株能逃避人樹突狀細(xì)胞的吞噬及機(jī)體的固有免疫應(yīng)答[17]。在構(gòu)建的腦膜炎模型中，D39ΔPavA 菌株感染小鼠的毒力明顯下降，且黏附A549、Hep-2細(xì)胞、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的能力也受到了明顯的抑制[18]。

2SP蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗

目前，尚未見單一SP蛋白質(zhì)疫苗保護(hù)作用強(qiáng)于PPV23的報道。因此，研究者將不同毒力因子進(jìn)行組合以制備SP蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗，且蛋白間的共同作用可能起互補效應(yīng)。文獻(xiàn)報道，重組PhtD及PspA聯(lián)合疫苗即將啟動Ⅱ期臨床。

2.1多價重組蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗Briles等[19]將混合后的PspA、PsaA經(jīng)鼻腔免疫小鼠,比二者單獨免疫更能有效阻止SP在鼻咽部的定植。在19F所致的肺炎模型中，證實PspA和Ply聯(lián)合免疫能有效抵抗菌血癥甚至是敗血癥[20]。Ogunniyi等[21]研究發(fā)現(xiàn)，與單個蛋白免疫相比，將PdB、PspA、PspC等兩兩組合，能顯著提高不同血清型SP侵襲性感染小鼠的中位生存率，且3種蛋白聯(lián)合主動免疫小鼠能使保護(hù)效果達(dá)到最佳。在近期的臨床對照研究中，SP膽堿結(jié)合蛋白A (PcpA)+ PhtD+ PlyD1三者聯(lián)合疫苗主動免疫不同年齡階段人群，顯示出較高的安全性及免疫原性[22]。但是，也有3種蛋白抗原聯(lián)合的保護(hù)作用不及兩兩聯(lián)合者的報道，可能為聯(lián)合免疫存在拮抗效應(yīng)所致。因此，仍需繼續(xù)臨床前嘗試，力爭找出最優(yōu)化的多價重組蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗。

2.2多價蛋白質(zhì)融合疫苗融合蛋白是一種將表達(dá)不同蛋白的功能活性域聯(lián)合協(xié)同作用使融合蛋白性能被優(yōu)化,甚至產(chǎn)生新的生物學(xué)活性的新技術(shù)。Lu等[23]以PsaA-PspA融合蛋白免疫小鼠后，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生大量抗PsaA、PspA抗體，該抗體可以與表達(dá)異源PspA的不同血清型SP結(jié)合；在鼻咽部攻擊模型中，與無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)相比，經(jīng)融合蛋白免疫的小鼠可顯著減少其血及肺部定植的細(xì)菌量。融合蛋白PsaA-SP溶血素?zé)o毒衍生物(PdT)與SP細(xì)胞壁肽聚糖混合后經(jīng)鼻腔或皮下免疫小鼠，能引起血清中高滴度抗體和IL-17A的產(chǎn)生，并能在高毒力3型SP攻擊模型中提供保護(hù)[24]。

在Liu等[25]研究中首次證實了ΔA146Ply具有黏膜佐劑的功能， SP熱休克蛋白(DnaJ)-ΔA146Ply融合蛋白表達(dá)后通過黏膜途徑能誘導(dǎo)C57BL/6小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性抗體IgG和sIgA，能有效幫助小鼠抵抗SP在鼻咽部、肺部定植及致死性感染。而SP膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)活性肽與 Ply類毒素L460D融合后，其保護(hù)效力更為強(qiáng)大，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體除了能夠抵抗SP引起的各種侵襲性疾病(IPD)外，還具有潛在的抵抗其他引起腦膜疾病的病原菌的能力[26]。新近研究顯示，ΔA146Ply基因與 PsaA融合后，能促進(jìn)兒童黏膜免疫系統(tǒng)中Th1/Th17細(xì)胞增殖，有助于抗SP的CD4+T細(xì)胞免疫活性的發(fā)揮。融合蛋白是一種安全有效的新型疫苗，但在融合蛋白的構(gòu)建過程中難免會影響或破壞蛋白質(zhì)原有的結(jié)構(gòu)，從而影響其活性的發(fā)揮。因此，在進(jìn)行蛋白融合時應(yīng)選擇合理的方式，使兩種蛋白質(zhì)的效應(yīng)均得到最大程度發(fā)揮。

目前，PPV和PCV疫苗的保護(hù)效果僅覆蓋部分SP血清型別，且存在血清型替換等諸多問題。因此，研發(fā)新型蛋白質(zhì)疫苗迫在眉睫。當(dāng)前，研究者多選擇與SP致病過程密切相關(guān)的的多價蛋白質(zhì)聯(lián)合或者蛋白融合疫苗為研究對象，以觀察其對實驗動物是否具有顯著的保護(hù)效應(yīng)。迄今為止，尚無FDA批準(zhǔn)的SP蛋白質(zhì)疫苗上市，但隨著相關(guān)研究的不斷深入，多價SP蛋白質(zhì)疫苗必將造福于人類。

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(收稿日期：2015-11-23)

中圖分類號：R378.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)10-0102-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.046

通信作者：閔迅(E-mail: 2815400619@.com)

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81460317)；貴州省聯(lián)合基金項目(黔科合LH字[2014]7553號)。