蔡 巖，趙曉青，李繼宏，周 捷，周長軍，趙亞力，惠 琦*

(1.長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長春 130062;2.吉林亞泰生物藥業(yè)股份有限責(zé)任公司，吉林 長春 130033)

據(jù)衛(wèi)生部公布的我國法定傳染病疫情概況顯示，近十年乙型肝炎和肺結(jié)核的發(fā)病數(shù)一直位居乙類傳染病之首，是長期以來嚴(yán)重影響國民公共健康的傳染病。因此，預(yù)防乙型肝炎和結(jié)核病，仍是我國一項(xiàng)長期而艱巨的任務(wù)。卡介苗優(yōu)化乙型肝炎疫苗的免疫應(yīng)答作用已見報(bào)道［1-2］。為檢查乙型肝炎卡介苗聯(lián)合疫苗(簡稱HBV-BCG聯(lián)合疫苗)中乙肝表面抗原(簡稱HBsAg)是否存在促使卡介苗(簡稱BCG)毒力增強(qiáng)的潛在因素，即HBsAg能否使BCG引起的良性免疫病理反應(yīng)，演變?yōu)閻盒曰慕Y(jié)核性病變，本文系統(tǒng)觀察了皮內(nèi)注射用HBV-BCG聯(lián)合疫苗皮下免疫豚鼠的毒性病理損傷，并比較了HBV-BCG聯(lián)合疫苗與單價(jià)BCG接種小鼠局部皮膚的毒性反應(yīng)及可逆性變化，為HBV-BCG聯(lián)合疫苗臨床前安全性評(píng)價(jià)提供病理資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 BCG:批號(hào) 20021225，規(guī)格 10人份/支;HBV-BCG聯(lián)合疫苗:批號(hào)20021208，規(guī)格HBsAg 10 μg 和 BCG 0.05 mg/人份;凍干保護(hù)劑0.2 mL/支。保存條件4℃，均為長春生物制品研究所試制。

1.1.2 豚鼠 18只，體重350～400 g，雌雄各半。長春生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，試驗(yàn)前每只豚鼠的PPD試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。

1.1.3 BALB/c小鼠 60 只，體重 14 ～15 g，雌雄各半，長春生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，試驗(yàn)前所有小鼠的PPD試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理 18只豚鼠分為3組，每組6只。設(shè)空白對(duì)照組、BCG免疫組和HBV-BCG聯(lián)合疫苗組，空白對(duì)照組未接種任何材料;BCG組于腹部左側(cè)腹股溝皮下接種BCG 50人份/只(1 mL)，HBV-BCG聯(lián)合疫苗組于腹部左側(cè)腹股溝皮下接種 HBV-BCG聯(lián)合疫苗 50人份/只(1.25 mL)，上述3組動(dòng)物觀察至42天全部活殺。60只小鼠分為3組。設(shè)對(duì)照組6只、BCG組和HBVBCG聯(lián)合疫苗組各27只。對(duì)照組于腹部皮內(nèi)接種凍干保護(hù)劑0.2 mL/只，1次;BCG免疫組于腹部皮內(nèi)接種BCG 0.1 mL/只，1次;HBV-BCG聯(lián)合疫苗組于腹部皮內(nèi)接種HBV-BCG聯(lián)合疫苗0.1 mL/只，1次。上述3組小鼠分別于接種后觀察至第 3、5、7、9、11、15、20、25、30 天各活殺 3 只。

1.2.2 大體剖檢及病理組織學(xué)觀察 各組動(dòng)物按計(jì)劃系統(tǒng)解剖，經(jīng)肉眼檢查胸腔、胸膜、雙肺各葉、心包膜、心、腹腔、腹膜、大網(wǎng)膜、肝、脾、胰、腎、腎上腺、頸淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、接種局部皮膚及左右側(cè)鼠蹊部淋巴結(jié)、生殖器、胃、腸和腦等。豚鼠從肺、肺門淋巴結(jié)、肝、脾、接種局部皮膚、左右側(cè)蹊部淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)等部位取材。小鼠從接種局部皮膚取材。將上述選取的組織塊固定于4%中性甲醛液中，常規(guī)病理制片，HE染色，病理組織學(xué)觀察和顯微照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 豚鼠大體剖檢

空白對(duì)照組豚鼠體表和各臟器組織均未見異常。BCG組有4只豚鼠(4/6)接種局部皮膚可見膿瘍，HBV-BCG聯(lián)合疫苗組有3只豚鼠(3/6)接種局部皮膚可見膿瘍，BCG組和HBV-BCG聯(lián)合疫苗組大體剖檢各臟器組織經(jīng)肉眼檢查均未見明顯異常及差異，也未見結(jié)核性病灶。

2.2 豚鼠病理組織學(xué)觀察

2.2.1 空白對(duì)照組 肺、肺門淋巴結(jié)、肝、脾、左右側(cè)鼠蹊部皮膚、左右側(cè)鼠蹊部淋巴結(jié)及腸系膜淋巴結(jié)等臟器組織結(jié)構(gòu)均未見異常。

2.2.2 BCG組與HBV-BCG聯(lián)合疫苗組 其接種疫苗局部及各臟器的病理改變相似，未見明顯差異，故合并描述。

①接種局部皮膚:主要表現(xiàn)以增生為主的炎癥改變，形成以巨噬細(xì)胞和類上皮細(xì)胞增生為主的肉芽腫。在接種局部的真皮層、皮下組織乃至肌層，可見大量密集的巨噬細(xì)胞及多少不等的類上皮細(xì)胞增生，形成特征性肉芽腫，在肉芽腫內(nèi)可散在多少不等的嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤。肉芽腫的周邊部也見上述相同的炎性細(xì)胞浸潤及大量纖維組織增生包繞。在上述巨噬細(xì)胞、類上皮細(xì)胞肉芽腫內(nèi)可見由嗜中性粒細(xì)胞形成的小膿腫;或者由郎罕氏巨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及類上皮細(xì)胞構(gòu)成的小肉芽腫(圖1)。上述肉芽腫內(nèi)未見干酪樣壞死，或者轉(zhuǎn)向惡性化的結(jié)核性病變。在上述肉芽腫表面的表皮可呈現(xiàn)局灶性增生，或者壞死脫落形成局灶性小潰瘍，潰瘍邊緣表皮增生明顯。

圖1 豚鼠皮膚肉芽腫(HE×50)Fig.1 Guinea pig skin granuloma

②左、右側(cè)蹊部淋巴結(jié):淋巴結(jié)皮質(zhì)內(nèi)可見多少不等巨噬細(xì)胞增生，有的形成以巨噬細(xì)胞為主的肉芽腫，肉芽腫內(nèi)可見郎罕氏巨細(xì)胞(圖2)。有的巨噬細(xì)胞肉芽腫可互相融合形成大片肉芽腫。除上述之外，皮質(zhì)內(nèi)的淋巴濾泡有不同程度增生，生發(fā)中心活躍、擴(kuò)大，尤其副皮質(zhì)區(qū)T淋巴細(xì)胞增生明顯，使副皮質(zhì)區(qū)增寬。

圖2 豚鼠蹊部淋巴結(jié)皮質(zhì)肉芽腫(HE×50)Fig.2 Guinea pig lymph node granuloma

③肺門淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié):皮質(zhì)內(nèi)的淋巴濾泡及副皮質(zhì)區(qū)也見與蹊部淋巴結(jié)相似的改變，但改變程度輕于后者。皮質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞輕度增生(圖3)。

圖3 豚鼠肺門淋巴結(jié)皮質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞輕度增生(HE×50)Fig.3 Guinea pig pulmonary hilar lymph node cortex in mild hyperplasia macrophage

④其他臟器改變:肺內(nèi)可見非特異性局限性慢性炎癥細(xì)胞浸潤，這種改變也見于對(duì)照組豚鼠，故它與疫苗的相關(guān)性尚不清楚;肝、脾及其余各臟器均未見與疫苗相關(guān)的病理改變。

2.3 小鼠大體剖檢

對(duì)照組小鼠體表和各臟器組織均未見異常。BCG組有1只小鼠(1/27)接種局部皮膚可見膿瘍，其余小鼠體表均未見異常;HBV-BCG聯(lián)合疫苗組有6只小鼠(6/27)接種局部皮膚可見膿瘍，其余小鼠體表均未見異常;BCG免疫組和HBVBCG聯(lián)合疫苗組小鼠各臟器組織未見明顯異常及差異，均未見結(jié)核性病灶。

2.4 小鼠病理組織學(xué)觀察

2.4.1 對(duì)照組 6只小鼠接種局部皮膚組織均未見異常。

2.4.2 BCG組及 HBV-BCG聯(lián)合疫苗組 該2組在接種局部皮膚的病變相似，故合并描述。

①早期局部皮膚病變(接種BCG、HBV-BCG聯(lián)合疫苗3～9 d):真皮層、皮下組織及肌層均呈現(xiàn)明顯非特異性炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)以嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主炎性細(xì)胞浸潤，其間尚見嗜中性粒細(xì)胞性小膿腫形成，此種非特異性炎癥反應(yīng)在7 d以后逐漸吸收，趨向減弱。此期有部分小鼠表皮、真皮層乃至皮下組織可見局灶性壞死，壞死的表皮或真皮淺層脫失形成潰瘍，潰瘍面可見膿性滲出物;潰瘍邊緣的表皮增生(圖4)。

②中期局部皮膚病變(接種BCG、HBV-BCG聯(lián)合疫苗11～25 d):真皮層、皮下組織及肌層的非特異性炎癥逐漸被吸收減輕，病灶趨于局限化。此期在接種局部皮膚表現(xiàn)以增生為主的病變，形成特異性巨噬細(xì)胞及類上皮細(xì)胞肉芽腫。在真皮層、皮下組織及肌層可見成片的巨噬細(xì)胞及類上皮細(xì)胞增生，形成類上皮細(xì)胞肉芽腫，在類上皮細(xì)胞肉芽腫中散在較多中性粒細(xì)胞及多少不等的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(圖5)。

圖4 小鼠皮膚非特異性炎癥(5 d)(HE×50)Fig.4 Non-specific inflammation of mouse skin

圖5 小鼠皮膚特異性類上皮細(xì)胞肉芽腫(20 d)(HE×50)Fig.5 Specific epithelioid cell granuloma of mouse

③中期末局部皮膚病變(接種BCG、HBVBCG聯(lián)合疫苗30 d):類上皮細(xì)胞肉芽腫內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤明顯消退，肉芽腫的范圍也明顯縮小(圖6)。

圖6 小鼠皮膚肉芽腫內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤明顯消退(30 d)(HE×50)Fig.6 Mouse skin within the granulomatous inflammatory cell infiltration obviously extinction

3 討論

由試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，空白對(duì)照組豚鼠及小鼠局部皮膚組織皆未見異常。豚鼠全身各臟器也未見異常。與空白對(duì)照組相比，BCG組和HBV-BCG聯(lián)合疫苗組豚鼠及小鼠，在接種局部皮膚均發(fā)生非特異性炎癥反應(yīng)，以及由BCG引起的特異性巨噬細(xì)胞類上皮細(xì)胞肉芽腫。并且豚鼠局部淋巴結(jié)也見上述改變。

BCG組和HBV-BCG聯(lián)合疫苗組，該2組在接種局部皮膚及局部淋巴結(jié)的病變完全相似，未見明顯差異。在接種局部皮膚真皮層、皮下組織及更深層部位可見以巨噬細(xì)胞、類上皮細(xì)胞或者朗罕氏巨噬細(xì)胞增生形成肉芽腫。在該肉芽腫內(nèi)可見多少不等的嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，以及由嗜中性粒細(xì)胞形成的小膿腫。在上述肉芽腫內(nèi)均未見干酪樣壞死或者轉(zhuǎn)向惡性化的結(jié)核性病變。在肉芽腫表面可見表皮呈現(xiàn)局灶性增生或壞死形成局灶性潰瘍;肺門和腸系膜淋巴結(jié)皮質(zhì)內(nèi)的淋巴濾泡及副皮質(zhì)區(qū)也見與接種局部淋巴結(jié)相似的改變，但改變程度輕于后者;肺內(nèi)可見非特異性局限性慢性炎癥細(xì)胞浸潤(這種改變也見于對(duì)照組豚鼠);肝、脾及其余各臟器均未見與疫苗相關(guān)的病理改變。

BCG組和HBV-BCG聯(lián)合疫苗組小鼠，該2組接種局部皮膚的病理改變相似，未見明顯差異。即在接種疫苗的早期(3～9 d)，接種局部皮膚產(chǎn)生非特異性炎癥，在真皮深層、皮下組織及肌層表現(xiàn)嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，部分小鼠可見嗜中性粒細(xì)胞性小膿腫形成及局灶性表皮壞死潰瘍等改變;中期(11～25 d)接種局部皮膚表現(xiàn)以增生為主的特異性類上皮細(xì)胞肉芽腫形成;中期末(30 d)類上皮細(xì)胞肉芽腫內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤明顯消退，肉芽腫的范圍也明顯縮小。肉芽腫中心均未見干酪樣壞死，或轉(zhuǎn)向惡性化的結(jié)核性病變。這與Wilson Mayrink等［3］以卡介苗為佐劑給狗接種利什曼蟲疫苗的結(jié)果類似。

BCG接種人體也會(huì)產(chǎn)生接種局部化膿性反應(yīng)，此為卡介苗正常的接種反應(yīng)，當(dāng)皮內(nèi)接種時(shí)形成的潰瘍較淺，膿液容易排除體外，不會(huì)形成深部膿瘍，當(dāng)接種誤入皮下或深處，膿液受皮膚阻攔，不易排出，會(huì)形成深部膿瘍。人體接種卡介苗后2周左右局部出現(xiàn)紅腫浸潤，可隨后化膿形成小潰瘍，一般8 ～12周結(jié)痂［4］。

BCG或HBV-BCG聯(lián)合疫苗免疫豚鼠及小鼠，在局部皮膚，以及豚鼠蹊部、肺門和腸系膜淋巴結(jié)所產(chǎn)生的病理改變，符合BCG引起的病變特點(diǎn)，具有BCG原發(fā)性病變特征。與結(jié)核性病變有本質(zhì)區(qū)別。均未見干酪樣壞死或轉(zhuǎn)向惡性化的結(jié)核性病變［5-7］。

病理結(jié)果證實(shí)，HBsAg沒有使BCG引起的良性免疫病理反應(yīng)，演變?yōu)閻盒曰慕Y(jié)核性病變。說明HBsAg不具有促使BCG毒力增強(qiáng)的潛在危險(xiǎn)，證實(shí)HBV-BCG聯(lián)合疫苗與對(duì)照單價(jià)BCG相同具有可靠的安全性。

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