李圣杰，楊之斌

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，昆明650118)

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Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)分子在肝癌靶向治療中的研究進(jìn)展

李圣杰，楊之斌

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，昆明650118)

摘要：肝癌發(fā)病率及病死率均較高Wnt/β環(huán)連蛋白(β-catenin)信號通路中多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生異常改變都可能與肝癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，著力于該信號通路的靶向治療成為研究的熱點(diǎn)。目前，在肝癌中開展了以Wnt/β-catenin信號通路激活起始分子Wnt蛋白、胞膜Wnt受體和輔助受體、胞膜胞內(nèi)信號傳遞銜接子、胞內(nèi)復(fù)合體、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體及信號通路抑制子為靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)研究，應(yīng)用前景廣闊，但真正運(yùn)用于臨床尚需時(shí)日。

關(guān)鍵詞：原發(fā)性肝癌；Wnt蛋白；β連環(huán)蛋白；信號通路；靶向治療

目前，肝癌的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對其發(fā)生、發(fā)展有著重要作用，其中有關(guān)Wnt/β連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路研究最多且相關(guān)機(jī)制解釋較為清楚。Wnt/β-catenin通路由Wnt蛋白與跨膜受體結(jié)合，將Wnt信號傳遞至胞質(zhì)蛋白，經(jīng)過一系列的復(fù)雜反應(yīng)致使胞內(nèi)β-catenin水平增高，隨后β-catenin發(fā)生核移位，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合激活下游靶基因。其中，跨膜受體包括卷曲蛋白(Fzd)及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6 (LRP5/6)，胞質(zhì)蛋白包括散亂蛋白(Dvl)、結(jié)腸腺瘤樣息肉病蛋白(APC)、酪蛋白激酶1(CK1)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、軸蛋白(Axin)、β-catenin及泛素蛋白(Ub)等，核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子主要包括轉(zhuǎn)錄活化因子(CBP)及T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子/淋巴樣增強(qiáng)因子(TCF/LEF)等，下游靶基因則有c-myc、細(xì)胞周期蛋白(cyclin) D1、survivin、gastrin、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等。在多種高發(fā)性腫瘤中，Wnt/β-catenin信號通路都發(fā)揮了非常重要的作用，是腫瘤病理及靶向藥物研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)將Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)信號分子在肝癌靶向治療中的研究進(jìn)展作一綜述。

1以信號通路激活起始分子Wnt蛋白為靶點(diǎn)

作為Wnt信號的起始分子，目前已知的Wnt蛋白有19種。Wnt蛋白在細(xì)胞生長分化、胚胎形成及腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮著重要作用，抑制腫瘤Wnt蛋白與胞膜受體結(jié)合可作為有效的靶點(diǎn)[1]。Wei等[2]研究發(fā)現(xiàn)，抗Wnt-1抗體能夠有效地抑制β-catenin/TCF4轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)其靶基因c-myc、cyclin D1、survivin的表達(dá)，在兩種不同的肝癌細(xì)胞系中抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還能有效抑制裸鼠移植瘤的生長。

2以胞膜Wnt受體、輔助受體為靶點(diǎn)

Wnt受體Fzd是一類跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成，胞外區(qū)為一段半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)是與G蛋白偶聯(lián)受體類似的七螺旋跨膜結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)段是羧基端區(qū)域。Wnt配體通過與Fzd胞外段結(jié)合改變膜受體構(gòu)象將信號傳遞至胞內(nèi)。Wnt輔助受體LRP5/6也由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)，胞外區(qū)能協(xié)同F(xiàn)zd將胞外信號傳遞至胞內(nèi)，胞內(nèi)區(qū)可招募骨架蛋白(如Axin)并使其降解，促進(jìn)β-catenin的胞內(nèi)聚集[3]。研究證明，治療性單克隆抗體能夠有效結(jié)合Wnt受體的胞外域，通過切斷受體、配體的結(jié)合來阻斷Wnt信號的傳遞，因此，F(xiàn)zd以及LRP5/6蛋白都是這類治療方式的潛在靶點(diǎn)。Gurney等[4]發(fā)現(xiàn)一種OMP-18R5單克隆抗體能夠與Fzd1、Fzd2、Fzd5、Fzd7、Fzd8胞外段緊密結(jié)合，阻斷絕大多數(shù)起始于Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a等多種Wnt蛋白的致癌效應(yīng)信號，降低LRP6胞內(nèi)段的磷酸化及β-catenin的胞內(nèi)聚集，明顯抑制裸鼠移植瘤的生長。目前，美國OncoMed公司正進(jìn)行OMP-18R5的臨床一期試驗(yàn)。另外一種特異性靶向結(jié)合Fzd8的單克隆抗體OMP-54F28[5]則能阻斷所有的Wnt配體與Fzd8結(jié)合，從而阻斷Wnt信號傳遞，其一期臨床試驗(yàn)正由拜耳公司著手進(jìn)行。此外，Wei等[6]發(fā)現(xiàn)，可溶性Fzd7能夠與胞外Wnt3a配體結(jié)合，競爭性抑制Wnt3a配體與胞膜Fzd7受體結(jié)合，抑制Wnt/β-catenin信號傳遞，降低肝癌細(xì)胞生存能力，正常肝細(xì)胞卻不受影響，并且還能增強(qiáng)阿霉素對肝癌細(xì)胞的抗增殖效應(yīng)。

3以胞膜胞內(nèi)信號傳遞銜接子Dvl為靶點(diǎn)

Dvl是將Wnt信號從胞膜傳遞到胞內(nèi)的關(guān)鍵蛋白，其含有3個(gè)保守的功能結(jié)構(gòu)域，即N端DIX結(jié)構(gòu)域、核心PDZ結(jié)構(gòu)域、C端DEP結(jié)構(gòu)域。DIX結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Dvl在受到Wnt信號刺激后發(fā)生聚集[7]；DEP結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞平面極性功能時(shí)保障與細(xì)胞膜上脂類緊密結(jié)合[8]；PDZ結(jié)構(gòu)域能與Fzd胞內(nèi)段直接結(jié)合，抑制GSK-3β活性，β-catenin的磷酸化過程受抑制，非磷酸化的β-catenin在胞內(nèi)聚集，從而將Wnt信號從胞膜傳遞到胞內(nèi)[9]。鑒于Dvl的PDZ結(jié)構(gòu)域與Fzd胞內(nèi)段在Wnt/β-catenin信號傳遞中起到重要的銜接作用，因此PDZ結(jié)構(gòu)能夠作為理想的藥物靶標(biāo)。Dapper蛋白可以與Dvl的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合，致使Dvl溶解，從而阻斷Dvl與Fzd結(jié)合[10]。類似于Dapper蛋白，一些小分子化合物例如NSC668036、J01-017a、3289-8625能與Dvl的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制Wnt/β-catenin信號傳遞。

4以胞內(nèi)復(fù)合體為靶點(diǎn)

Wnt信號通路中關(guān)鍵樞紐分子β-catenin由胞質(zhì)向胞核的轉(zhuǎn)位是該信號通路被激活后行使功能的標(biāo)志。Tien等[11]研究表明，β-catenin在肝癌細(xì)胞中表達(dá)陽性率高，細(xì)胞膜上表達(dá)高于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，在中、低分化肝癌的胞核中存在β-catenin的表達(dá)。胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin與GSK-3β、APC、Axin、CK1構(gòu)成的破壞復(fù)合體能介導(dǎo)β-catenin在胞內(nèi)被降解而處于較低的水平，當(dāng)該復(fù)合體受到破壞時(shí)β-catenin在胞內(nèi)大量集聚，進(jìn)而入核激活靶基因，因此胞內(nèi)β-catenin的水平在Wnt信號通路起著決定性作用[12]。降低胞質(zhì)內(nèi)β-catenin水平及抑制胞質(zhì)內(nèi)β-catenin向核內(nèi)轉(zhuǎn)移能有效抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展，是抗癌治療研究的重要分子靶位。Axin與APC在該復(fù)合體中扮演了骨架蛋白的作用，其他4種蛋白與之結(jié)合形成復(fù)合體，Axin、GSK-3β、CK1能調(diào)控β-catenin磷酸化促進(jìn)其泛素化降解過程。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，野生型Axin基因過表達(dá)能抑制肝癌細(xì)胞系的生長，促進(jìn)其凋亡，下調(diào)cyclin水平，負(fù)向調(diào)控β-catenin轉(zhuǎn)錄活性。有研究證實(shí)，小分子FH535能夠直接降低β-catenin水平從而抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖[14]。撲蟯靈(Pyrvinium)被認(rèn)為是CK1激活劑，能促進(jìn)β-catenin的泛素化降解過程[15]；然而，也有研究稱Pyrvinium對CK1并無直接激活作用，而是通過下調(diào)Akt/PKB及激活GSK-3β來調(diào)控β-catenin的泛素化降解[16]。Wang等[17]用小分子干擾RNA沉默β-catenin的表達(dá)后能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管生成。最近Gai等[18]發(fā)現(xiàn)，蟾毒靈(bufalin)能抑制GSK-3β上第9位絲氨酸殘基的磷酸化，從而降低β-catenin及其下游因子cyclin D1、MMP-7以及環(huán)氧合酶2在胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)水平，明顯降低肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力。

5以核內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體為靶點(diǎn)

在細(xì)胞核中，β-catenin能與不同的DNA結(jié)合蛋白進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而重組染色質(zhì)以調(diào)控轉(zhuǎn)錄程序。其中與β-catenin發(fā)生結(jié)合最重要的轉(zhuǎn)錄因子是TCF/LEF家族，包括TCF1、LEF1、TCF3、TCF4等。正常情況下核內(nèi)缺乏β-catenin，阻遏蛋白如交互轉(zhuǎn)導(dǎo)樣增強(qiáng)子蛋白(TLE)和C端結(jié)合蛋白(CTBP)可與TCF/LEF相互作用，介導(dǎo)組蛋白去乙?；腿旧w固縮來抑制下游靶基因表達(dá)。下游靶基因如cyclin D1、survivin、PCNA、c-myc等一旦被激活，能發(fā)揮出不同級聯(lián)的放大效應(yīng)：cyclin D1和PNCA一起調(diào)控著細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期；c-myc過表達(dá)則能維持腫瘤不斷生長并抵抗凋亡；survivin則主要介導(dǎo)腫瘤抗凋亡。由于β-catenin本身并不直接參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而是通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用實(shí)現(xiàn)對下游相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，因此抑制β-catenin與以TCF/LEF家族為代表的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，阻礙調(diào)控轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成，能阻斷信號通路往下游繼續(xù)發(fā)展，下游靶基因的表達(dá)受阻，從而抑制腫瘤進(jìn)程。Wei等[19]研究證明，PKF118-310，PKF115-584，CGP049090能抑制β-catenin/TCF4與靶基因DAN序列結(jié)合，在體內(nèi)外誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，將腫瘤細(xì)胞阻滯在G1/S期，并能明顯抑制小鼠移植瘤模型腫瘤生長。

6以信號通路抑制子為靶點(diǎn)

Wnt抑制蛋白1(WIF1)、分泌型卷曲蛋白相關(guān)蛋白(sFRP)能與Wnt配體結(jié)合，阻礙Wnt配體與膜Fzd受體結(jié)合，Dickkopf1(Dkk1)則能與能與LRP5/6結(jié)合抑制Wnt信號向下游傳遞。Hu等[20]用攜帶WIF1、sFRP基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)WIF1及 sFRP，并下調(diào)了E2F1、cyclin D1、c-myc等基因的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，延長實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存期，說明WIF1、sFRP能夠抑制Wnt信號通路抑制肝癌進(jìn)展。而Dkk1的腫瘤生物學(xué)特性至今存在爭議，一些研究提示Dkk1有抑制或促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的兩面性特征：一方面Dkk1被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的抑制子，例如González-Sancho等[21]研究發(fā)現(xiàn)Dkk1在結(jié)腸癌中低表達(dá)，提示Dkk1或許起到了腫瘤抑制子的作用；上調(diào)Dkk1的水平后，腸癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力明顯降低。另一方面Dkk1在非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、膀胱癌中呈現(xiàn)高表達(dá)水平；而消減了Dkk1表達(dá)后，肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲能力明顯減弱。Chen等[22]發(fā)現(xiàn)，Dkk1在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，上調(diào)Dkk1水平對肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成能力并無影響，但可以上調(diào)β-catenin及MMP-7促進(jìn)其轉(zhuǎn)移、侵襲能力。因此，對于Dkk1所扮演的角色我們?nèi)孕柽M(jìn)一步研究探索。

探索肝癌新療法一直是肝癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，然而肝癌靶向藥物治療現(xiàn)狀仍不容樂觀。目前，僅有索拉菲尼一種靶向藥物受到FDA批準(zhǔn)用于肝癌的治療，但由于其價(jià)格昂貴、不良反應(yīng)多及患者耐藥性的產(chǎn)生，使其應(yīng)用非常局限。Wnt/β-catenin信號通路在肝癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，基于該信號通路在肝癌靶向治療的研究有很多，前景雖廣闊，但要真正運(yùn)用于臨床仍有很長的路要走。只有對肝癌的發(fā)生、發(fā)展更加深入的認(rèn)識，盡可能詳盡地闡述Wnt/β-catenin信號通路與其他信號通路之間的關(guān)系，宏觀調(diào)控，精準(zhǔn)導(dǎo)向，也許不久的將來會給肝癌患者帶來福音。

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(收稿日期：2016-01-07)

中圖分類號：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)10-0099-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.045

通信作者：楊之斌(E-mail: yzblbab@vip.sina.com)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81560472)；云南省衛(wèi)生廳內(nèi)設(shè)機(jī)構(gòu)基金資助項(xiàng)目(2014NS017，2014NS018)；云南省衛(wèi)生廳昆醫(yī)聯(lián)合專項(xiàng)(2013FB166)。