魏巖冰，韓澤廣,2,3

(1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海200025；2國家人類基因組南方研究中心；3上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)院)

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EBLN2基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制

魏巖冰1，韓澤廣1,2,3

(1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海200025；2國家人類基因組南方研究中心；3上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)院)

目的 探討人類內(nèi)源性非逆轉(zhuǎn)錄博納病毒樣核蛋白序列2(EBLN2)基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制。方法 采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)和蛋白印跡技術(shù)檢測EBLN2基因在肝癌細(xì)胞系(HepG2、SK-hep-1、Huh7、Hep3B、MHCC-97H、PLC/PRF/5、Focus、SMMC7721、YY-8103、LO2)和人肝癌組織樣本中的表達(dá)；選取EBLN2表達(dá)水平較低的肝癌細(xì)胞株Focus和YY-8103進(jìn)行外轉(zhuǎn)質(zhì)粒過表達(dá)，Pcmv-EBLN2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞株Focus和YY-8103，24 h觀察EBLN2基因過表達(dá)對肝癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖、平板克隆形成能力及軟瓊脂克隆形成能力、細(xì)胞周期的影響。結(jié)果 定量和半定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EBLN2基因在59%的肝癌樣本中表達(dá)下調(diào)，且在10株肝癌細(xì)胞系(HepG2、SK-hep-1、Huh7、Hep3B、MHCC-97H、PLC/PRF/5、Focus、SMMC7721、YY-8103、LO2)中表達(dá)水平與正常肝組織相比明顯下調(diào)，依次下調(diào)48%、73%、72%、79%、84%、72%、87%、74%、82%、80%，P均<0.05；Pcmv-EBLN2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株YY-8103和Focus 24 h后，肝癌細(xì)胞株YY-8103和Focus的細(xì)胞增殖率分別為72.2%、85.0%，平板克隆形成率分別為52.6%、25.6%，軟瓊脂克隆形成率分別為40.9%、37.5%，與空白對照相比，P均<0.05；肝癌細(xì)胞株YY-8103和Focus從G1期進(jìn)入S期受到抑制。結(jié)論 EBLN2基因在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，其可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制肝癌細(xì)胞增殖。

肝細(xì)胞癌；人類內(nèi)源性非逆轉(zhuǎn)錄博納病毒樣核蛋白序列2基因；抑癌基因；細(xì)胞增殖

肝細(xì)胞癌(HCC)是肝癌最常見亞型，占肝癌確診和致死人數(shù)的70%～80%。盡管近年來肝癌治療手段不斷發(fā)展，但5年致死率仍約7%[1～5]。因此，研究肝癌發(fā)生的分子機(jī)制，尤其針對最新發(fā)現(xiàn)的癌基因和抑癌基因在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用對肝癌診斷、治療有重要意義[6, 7]。人類內(nèi)源性非逆轉(zhuǎn)錄博納病毒樣核蛋白序列(EBLNs)基因是最近研究發(fā)現(xiàn)的遠(yuǎn)古時(shí)期博納病毒核蛋白基因整合到人類染色體上并穩(wěn)定存在的基因家族[8～10]。EBLN2是該家族中的重要成員，在人類和其他哺乳動物中廣泛存在。有研究報(bào)道EBLN2基因在宿主細(xì)胞內(nèi)可能已進(jìn)化為有益成分，對宿主細(xì)胞起到一定保護(hù)作用[11]。然而，該基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中作用的研究鮮見報(bào)道。2014年12月～2015年12月，我們探討了EBLN2基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 本實(shí)驗(yàn)所用肝癌組織均取自上海市第十人民醫(yī)院病理科肝癌患者手術(shù)切除組織塊，患者手術(shù)前簽署知情同意書，并得到國家人類基因組南方研究中心道德理論委員會的批準(zhǔn)，離體組織塊-80 ℃保存。本實(shí)驗(yàn)中所用10株肝癌細(xì)胞株HepG2、SK-hep-1、Huh7、Hep3B、MHCC-97H、PLC/PRF/5、Focus、SMMC7721、YY-8103、LO2均為本中心液氮罐里實(shí)驗(yàn)室保存。所用試劑有TRIzol試劑，氯仿，Annexin-V FITC 和PI 雙染試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa公司預(yù)混Taq Premix polymerase 試劑盒，SYBR Premix ExTaq試劑盒，蛋白質(zhì)裂解液，瓊脂糖，SDS，蛋白質(zhì)甲巰基乙醇上樣緩沖液，Lipofectamine2000，DMEM培養(yǎng)液，胰酶，70%乙醇，磷酸鹽緩沖液，20%胎牛血清，碘化丙啶，考馬斯亮藍(lán)，RNase。儀器：六孔板，培養(yǎng)皿，EP管，滅菌鍋，培養(yǎng)箱，離心機(jī)，PCR儀，流式細(xì)胞分選儀，移液槍，超凈工作臺，電泳儀，酶標(biāo)儀，顯微鏡。

1.2 組織和細(xì)胞RNA提取 采用TRIzol法。稱取適量肝癌組織塊，在液氮條件下研磨粉末狀，取粉末于EP管中，加入TRIzol試劑裂解約15 min，貼壁細(xì)胞RNA提取時(shí)直接棄去配液并用PBS洗滌，加TRIzol裂解約15 min。然后采用酚-氯仿法抽提RNA，并用酶標(biāo)儀測定RNA濃度，注意RNA提取過程中無菌操作，所用EP管等為無RNase污染。使用TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的SYBR Green Assay試劑，根據(jù)試劑盒使用說明書，將2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分子，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 EBLN2基因表達(dá)檢測 采用RT-PCR和半定量RT-PCR法。目的基因EBLN2的RT-PCR引物：上游引物5′-GAACGAGGAAAGGGGTACTCC-3′；下游引物5′-CCAGCCGCAATGCCTATCAA-3′。內(nèi)參基因β-actin的RT-PCR引物：上游引物5′-AGCGAG-CATCCCCCAAAGTT-3′；下游引物5′-GGGCACGAA-GGCTCATCATCATT-3′。半定量PCR以cDNA為模板，用TaKaRa公司預(yù)混Taq Premix polymerase 試劑，擴(kuò)增目的片段和內(nèi)參基因，反應(yīng)體系：模板1 μL，預(yù)混聚合酶7.5 μL，上下游引物各1 μL；雙純水補(bǔ)至15 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；其中EBLN2擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，內(nèi)參基因擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)用TP800實(shí)時(shí)定量PCR儀和SYBR Premix ExTaq試劑盒進(jìn)行。反應(yīng)體系：預(yù)混的熒光Taq復(fù)合物12.5 μL；上、下游引物各1 μL；模板2 μL；雙純水補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4 EBLN2蛋白表達(dá)檢測 采用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測 EBLN2表達(dá)。細(xì)胞和組織樣品用蛋白裂解緩沖液提取蛋白質(zhì)甲巰基乙醇上樣緩沖液后95 ℃使蛋白質(zhì)變性，然后進(jìn)行SDS凝膠電泳，檢測目的基因蛋白表達(dá)。β-actin作內(nèi)參。

1.5 Pcmv-EBLN2轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞Focus和YY-8103 選取EBLN2表達(dá)水平較低的細(xì)胞株(Focus和YY-8103)進(jìn)行外轉(zhuǎn)質(zhì)粒過表達(dá)，Pcmv-EBLN2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞株Focus和YY-8103，細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑。Pcmv-EBLN2質(zhì)粒引物：EBLN2上游引物(Sal I)5′-ACGCGTCGACTATGGGTTATTTTCTTAAATTGTATG-CT-3′；下游引物(Not I)5′-ATAAGAATGCGGCCGCCTAACTTGCGTAGCTTGTGTA-3′。轉(zhuǎn)染前1 d接種適量細(xì)胞，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞數(shù)量達(dá)70%左右。以3.5 cm培養(yǎng)皿為例，轉(zhuǎn)染時(shí)取5 μL脂質(zhì)體與250 μL無血清的基本培養(yǎng)基混合，2 μg質(zhì)粒與250 μL無血清基本培養(yǎng)基混合，室溫靜置5 min；將上述兩種混合液混合并室溫靜置30 min，加入至無抗生素?zé)o血清的培養(yǎng)基細(xì)胞中；培養(yǎng)箱培養(yǎng)，約4 h后更換成完全培養(yǎng)基，獲得EBLN2過表達(dá)肝癌細(xì)胞株Focus和YY-8103。

1.6 EBLN2過表達(dá)肝癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖的檢測 肝癌細(xì)胞株Focus和YY-8103轉(zhuǎn)染48 h后接種至96孔板中，每孔接種約3×103個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后以24 h為1個(gè)檢測單位，每孔待測細(xì)胞中加入CCK-8 10 μL，培養(yǎng)箱培育1 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測吸光度值，繪制生長曲線，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.7 EBLN2過表達(dá)肝癌細(xì)胞株細(xì)胞克隆形成率的測算 肝癌細(xì)胞株Focus和YY-8103轉(zhuǎn)染48 h后接種到六孔板，每孔約3 000個(gè)細(xì)胞，用含終濃度為4～8 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每周更換一次培養(yǎng)液，觀察2～3周時(shí)用考馬斯亮藍(lán)染色并拍照，觀察整體細(xì)胞克隆數(shù)目。

1.8 EBLN2過表達(dá)肝癌細(xì)胞株軟瓊脂克隆形成率的測算 分別配制1%和2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖，高溫滅菌處理；配制2×DMEM，含20%胎牛血清的2×DMEM和2%的低熔點(diǎn)瓊脂糖等體積混合，加入24孔板，每孔500 μL，冰箱放置約10 min至凝固；用胰酶消化細(xì)胞，每孔接種約3 000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞懸液與1%的瓊脂糖等體積混合；每孔加入500 μL于下層膠上；冰箱放置約10 min；凝固后每孔加入約100 μL普通新鮮配液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)約3周，顯微鏡下觀察每個(gè)孔的克隆數(shù)目并拍照進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.9 EBLN2過表達(dá)肝癌細(xì)胞株細(xì)胞周期的檢測 采用流式細(xì)胞分析儀檢測。Pcmv-EBLN2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞株Focus和YY-8103 48 h后用胰酶消化成單細(xì)胞，收集到15 mL離心管中離心，用磷酸鹽緩沖液洗滌單細(xì)胞2～3次；70%乙醇固定細(xì)胞；碘化丙啶避光染色10 min，同時(shí)加入RNase；上樣檢測，每個(gè)樣品收集10萬個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行流式分選。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad prissm5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，各樣本間的差異計(jì)算采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肝癌細(xì)胞株中EBLN2表達(dá)比較 定量和半定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EBLN2基因在59%的肝癌組織樣本中表達(dá)下調(diào)，EBLN2基因在HCC細(xì)胞株中表達(dá)水平較低，10株肝癌細(xì)胞系(HepG2、SK-hep-1、Huh7、Hep3B、MHCC-97H、PLC/PRF/5、Focus、SMMC7721、YY-8103、LO2、)中EBLN2蛋白相對表達(dá)量依次為0.048±0.000 5、0.073±0.000 5、0.072±0.000 5、0.079±0.000 5、0.084±0.000 5、0.072±0.000 5、0.087±0.000 5、0.074±0.000 5、0.082±0.000 5、0.080±0.000 5。

2.2EBLN2 過表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成和軟瓊脂克隆形成的影響 與空白對照相比，肝癌細(xì)胞株Focus和YY-8103細(xì)胞增殖率分別為72.2%、85%，平板克隆形成率分別為52.6%、25.6%；軟瓊脂克隆形成率分別為40.9%、37.5%，P均<0.05。

2.3EBLN2過表達(dá)對肝癌細(xì)胞周期的影響 與空白對照相比，肝癌細(xì)胞株Focus和YY-8103細(xì)胞停滯于G1期。

3 討論

目前對于哺乳動物基因插入病毒基因序列的研究已較清晰，即插入片段對病毒具有選擇性保護(hù)作用。然而，內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄或非逆轉(zhuǎn)錄病毒基因序列插入哺乳動物基因組后在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的作用及其作用機(jī)制仍不清晰。

EBLN基因是最新研究發(fā)現(xiàn)并命名的一類基因家族，最初由博納病毒基因整合至多種哺乳動物基因組DNA序列，并在宿主細(xì)胞內(nèi)傳遞和進(jìn)化[12,13]。EBLN家族中的部分成員包括完整的開放閱讀框，能表達(dá)mRNA。在類基因組中包括EBLN1、EBLN2、EBLN3和EBLN4四個(gè)成員，其中EBLN1與EBLN2同源性較高，且均能在宿主細(xì)胞內(nèi)翻譯出蛋白質(zhì)分子。最近有報(bào)道EBLN2可與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)AP1S1、TUSC2/FUS1及FANCC相互作用[14]，此暗示EBLN家族成員可能表達(dá)功能性蛋白質(zhì)。而關(guān)于EBLN2基因在肺癌樣本中表達(dá)明顯下調(diào)甚至消失的報(bào)道說明EBLN2可能在宿主細(xì)胞內(nèi)作為抑癌基因起作用；同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)EBLN2基因在乳腺癌和宮頸癌中表達(dá)亦明顯下調(diào)[15]。然而對該基因在肝癌中的探究鮮見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，EBLN2在肝癌樣本中與癌旁組織相比表達(dá)明顯下調(diào)；同時(shí)，EBLN2在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)水平較低，提示EBLN2可能在肝癌發(fā)生中有一定作用。此外，過表達(dá)EBLN2能顯著抑制肝癌細(xì)胞Focus和YY-8103的生長、克隆形成和軟瓊脂克隆形成。EBLN2基因過表達(dá)后Focus和YY-8103細(xì)胞的增殖過程被阻滯于G0～G1期。肝癌細(xì)胞的無限增殖和非錨定增殖是惡性腫瘤的重要特性，我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明EBLN2基因能明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖和非錨定生長過程，EBLN2基因可能在肝癌細(xì)胞系中發(fā)揮抑癌基因功能。

綜上所述，EBLN2基因在人肝細(xì)胞內(nèi)可能已共同化為對宿主細(xì)胞有益的抑癌基因，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞株增殖的作用，此為內(nèi)源性病毒元件與宿主細(xì)胞的共同進(jìn)化提供了科學(xué)依據(jù)。

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Inhibitory effect of EBLN2 gene on proliferation of hepatocellular carcinoma cells

WEIYanbing1,HANZeguang

(1RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China)

Objective To study the inhibitory effects of endogenous Bornavirus-like nucleoprotein 2 (EBLN2) gene on proliferation of hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines and its mechimasm. Methods The real-time fluorescent quantitative RT-PCR and Western blotting was used to detect the expression of EBLN2 in HCC cell lines (HepG2, SK-hep-1, Huh7, Hep3B, MHCC-97H, PLC/PRF/5, Focus, SMMC7721, YY-8103 and LO2) and human HCC tissue samples. The overexpression of EBLN2 was carried out in Focus and YY-8103 cells with low expression of EBLN2. The recombinant plasmid pCMV-EBLN2 was transfected into Focus and YY-8103 cells.At 24 h, the effects of overexpression of EBLN2 gene on the proliferation of HCC cell lines, plate clone formation ability, soft agar clone formation ability, and cell cycle.Results The quantitative and semi-quantitative PCR results showed that EBLN2 mRNA expression was down-regulated in 59% HCC samples. Further, compared with the normal hepatic tissues, EBLN2 expression was down-regulated in cell lines such as HepG2, SK-hep-1, Huh7, Hep3B, MHCC-97H, PLC/PRF/5, Focus, SMMC7721, YY-8103 and LO2 with the percentage of 48%, 73%, 72%, 79%, 84%, 72%, 87%, 74%, 82% and 80%, respectively (allP<0.05). After the Pcmv-EBLN2 plasmid was transferred into cell lines YY- 8103 and Focus for 24 h, the proliferation rates of YY-8103 and Focus cell lines were 72.2% and 85%. The plate clone formation rates of YY-8103 and Focus cells were 52.6% and 25.6%, and the soft agar clone formation rates of YY-8103 and Focus cells were 40.9% and 37.5%, and significant difference was found, allP<0.05. The cell cycle transition from G1phase to S phase was inhibited in the YY-8103 and Focus cells.Conclusions EBLN2 is down-regulated in HCC tissues and inhibits the proliferation of HCC cells by regulating the cell cycle.

hepatocellular carcinoma; endogenous Bornavirus-like nucleoprotein 2; tumor suppressor gene; cell proliferation

國家科技重大專項(xiàng)課題(2012zx10001012)。

魏巖冰(1988-)，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)槟[瘤(肝癌)分子遺傳學(xué)。E-mail：wyb2013@sjtu.edu.cn

簡介：韓澤廣(1964-)，男，博士，教授，主要研究方向?yàn)槟[瘤(肝癌)分子遺傳學(xué)、基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)應(yīng)用。E-mail：hanzg@sjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.002

R735.7

A

1002-266X(2016)41-0006-04

2016-06-20)