呂少茵 江西省上饒市廣豐區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所 （江西 上饒 334600）

熒光定量PCR儀檢測瘧原蟲的研究分析

呂少茵 江西省上饒市廣豐區(qū)衛(wèi)生監(jiān)督所 （江西 上饒 334600）

目的：探討熒光定量PCR儀檢測瘧原蟲的應用價值。方法：選取我省出入境單位收集到的已經(jīng)鏡檢法證實為惡性瘧疾的全血樣本32例、鏡檢為陰性的全血樣本13例作為研究對象，所有樣本中均提取DNA并加入RT-PCR檢測試劑進行熒光定量PCR儀檢測，觀察分析檢測結(jié)果。結(jié)果：熒光定量PCR儀檢測結(jié)果顯示：惡性瘧疾全血樣本23例、間日瘧疾全血樣本11例，陰性全血樣本11例，診斷符合率95.6%。復檢結(jié)果顯示：2例標本通過PCR擴增、序列對照，發(fā)現(xiàn)其測序結(jié)果與公布的瘧原蟲序列一致，確定均含有瘧原蟲。結(jié)論：熒光定量PCR儀檢測瘧原蟲的應用價值高，能夠敏感、可靠的檢出瘧原蟲DNA。

熒光定量PCR儀 瘧原蟲 瘧疾診斷

瘧疾是由瘧原蟲所致的蟲媒傳染病，屬于全球性流行傳染病，尤其是在非洲、中南美洲、東南亞的一些國家，惡性瘧死亡率極高，因此加強瘧疾診斷至關重要。當前鏡檢仍然是瘧疾診斷的主要方法，但是由于國外瘧區(qū)人群普遍服用抗瘧藥物在一定程度改變了原蟲的正常形態(tài)，因此對鏡檢要求也逐漸提高，耗費的人力物力也明顯增長[1,2]。近年來，瘧原蟲檢測手段更加多樣，本研究中主要探討實時熒光定量PCR儀檢測瘧原蟲的應用價值，現(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1.材料與方法

1.1 一般資料

選取我省出入境單位2014年1月～2015年10月收集到的已經(jīng)鏡檢法證實為惡性瘧疾的全血樣本32例（其中惡性瘧疾全血樣本23例，間日瘧疾全血樣本9例）、鏡檢為陰性的全血樣本13例作為研究對象，將標本放置于抗凝管中，在4°C冰箱保存。

儀器和試劑：①儀器：熒光定量PCR儀（北京線上生物科技有限公司生產(chǎn)，美國ABI-2720 PCR儀），測量范圍：4°C-99°C適用范圍：2.7°C/s |品牌：ABI |溫度范圍：4°C-99°C，由熒光定量系統(tǒng)和計算機組成。②試劑：核酸釋放劑（湖南圣湘生物科技有限公司研發(fā)），可提取樣本中的瘧原蟲DNA，采用熒光定量PCR儀器進行瘧原蟲核酸檢測。采用該試劑進行瘧原蟲DNA內(nèi)標設置，于內(nèi)標TaqMan探針處末端進行HEX熒光素標記，檢測內(nèi)標是否正常、標本中是否有PCR抑制物，有助于提高檢測精確性，避免假陰性；設置防污染措施UNG+dutp，排除假陽性。

1.2 方法

制備瘧原蟲DNA模板：將全血樣本進行離心處理，首先取200μL血液置于1.5mL離心管中，在其中添加中800μL紅細胞裂解液，手動劇烈振蕩管體15s至出現(xiàn)顏色清亮，4°C下離心1min（轉(zhuǎn)速12000rpm/min）后可見白色沉淀；添加800μL核酸釋放劑添加在沉淀中混合搖勻，離心后去上清，每1mLTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1mL的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），去除沉淀，混勻后在4°C下7000rpm離心5min，小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5～10min，將最終的沉淀物進行分離得到的核酸，取5μL作為待測樣本。

引物、探針的設計：引物、探針的設計需參照惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲的18sRNA基因共有保守序列，并采用Clustal version2.1進行多序列比對，最終確定引物、探針序列：P.falciparum:FAL-5︱-GCTTTTGAGAG GTTTTGTTACTTTGAGT；FAL-5︱-TGTTATTCCATGCT GTAGTATTCAAACAC；FAL paobe(FAM)-5︱-TGTT CATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA。P.vivax: VIV-F5︱-ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT；VIV-F5︱-CTCAAACTAACAAGGACTTCCAAGC；VIV paobe (TET)-5︱-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC。特異性比對后進行生物合成。

表1. 不符樣本的復核情況

PCR擴增：在熒光定量PCR儀放置熒光反應管，將參數(shù)設置為：94°C/5min，94°C/15s，57°C/91s，共45個循環(huán)；25°C/30s；單點檢測在57°C；反應體系設置為50μL，上機后進行擴增。

1.3 結(jié)果判定

陰性：標本FAM通道Ct欄顯示UNDET或者40，表明＜400copis/mL（最低檢測限）；陽性：標本FAM通道Ct欄顯示≤38.如果樣本FAM通道Ct欄數(shù)值顯示38～40，需重復檢測，如果兩次結(jié)果相同，則為陰性。

2.結(jié)果

2.1 熒光RT-PCR檢測與鏡檢法的一致性

本研究中共有全血樣本45例，其中惡性瘧疾全血樣本23例，間日瘧疾全血樣本9例，陰性全血樣本13例。熒光定量PCR儀檢測結(jié)果顯示：惡性瘧疾全血樣本23例、間日瘧疾全血樣本11例，陰性全血樣本11例。診斷符合率95.6%。

2.2 不符樣本的復核情況

研究中有2例標本初次熒光定量PCR儀檢測結(jié)果均為陽性，但是鏡檢為陰性，因此對2例標本進行復檢，通過PCR擴增、引物及探針序列對照，發(fā)現(xiàn)其測序結(jié)果與公布的瘧原蟲序列一致沒確定均含有瘧原蟲。見表1。

3.討論

瘧疾是危害人類健康的重要傳染病，據(jù)資料顯示流行于102個國家和地區(qū)，每年發(fā)病人數(shù)約有2.5億，死亡患者約有10萬人，因此探索科學有效的方法進行疾病診斷具有重要的臨床價值，有助于分析瘧原蟲感染疾病發(fā)展進程以及進行臨床療效評估。

傳統(tǒng)的鏡檢法在瘧原蟲DNA載體量較低的情況下難以檢出，且難以反映瘧原蟲的真實水平。采用熒光定量PCR儀進行檢測是新型的瘧疾診斷方法，主要是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實現(xiàn)對整個PCR進程實時監(jiān)測，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法，簡化了定量檢測的過程，真正實現(xiàn)了絕對定量，工作效率高。當前國內(nèi)生產(chǎn)的PCR試劑較為多樣，但是這些試劑對不同類型的樣本、瘧原蟲DNA病毒各型檢測陽性率存在差異，最根本的原因在于核酸提取及其純化方法存在漏洞[3]。本研究結(jié)果顯示：熒光定量PCR儀檢測與鏡檢法結(jié)果的診斷符合率為95.6%，且通過PCR擴增、序列對照發(fā)現(xiàn)其測序結(jié)果與公布的瘧原蟲序列一致，確定血液標本中均含有瘧原蟲，可見熒光定量PCR儀檢測方法對全血樣本的檢測更為全面細致，能夠有效減少假陰性結(jié)果的發(fā)生機率。另外本研究還存在一定的不足，例如全血樣本數(shù)量搜集過少，未能嚴格評價熒光PCR試劑的線性范圍，未來研究中仍需進一步探討。

綜上所述，熒光定量PCR儀檢測瘧原蟲的應用價值高能夠敏感、可靠的檢出瘧原蟲DNA。

[1] 魯少平, 鄧中平, 龍妍嬌, 等. 運用實時熒光RT-PCR方法檢測瘧原蟲的研究[J]. 實用預防醫(yī)學, 2015,22(10):1171-1173,1170.

[2] 陳玉鳳, 王艷艷, 姜杰, 等. 應用巢式PCR評價低流行區(qū)瘧疾診斷結(jié)果[J]. 國際醫(yī)學寄生蟲病雜志, 2013,40(6):311-316.

[3] 王艷艷. 影響約氏瘧原蟲在按蚊體內(nèi)發(fā)育的因素及機制的初步研究[D]. 重慶:第三軍醫(yī)大學, 2011.

1006-6586(2016)09-0034-02

R382.3+1

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