龔惠，陳志丹，鄒云增

（復旦大學附屬中山醫(yī)院上海市心血管病研究所，上海200032）

干細胞與心肌再生

龔惠，陳志丹，鄒云增

（復旦大學附屬中山醫(yī)院上海市心血管病研究所，上海200032）

由于成年心肌細胞通常不能再生，嚴重的心肌損傷會導致心肌不可逆的重構壞死，從而發(fā)生心功能失調.干細胞再生治療為心肌再生提供了很好的策略.為了尋找合適的干細胞類型，促進心肌再生，有效改善心功能，需要更好地了解心肌修復和再生的分子基礎.已有研究發(fā)現(xiàn)多種干細胞可促進心肌再生.描述了骨髓干細胞的促血管新生及心肌分化的能力在心梗治療中的作用，還討論了心臟側群干細胞以及誘導型多能干細胞在心肌再生中的作用和分子機制.所闡述的最新數(shù)據(jù)有利于拓展干細胞治療的有效潛能及臨床影響.

干細胞；心肌再生；骨髓干細胞；心臟側群干細胞；誘導型多能干細胞

冠心病及高血壓等原因會引起心肌缺血，心臟發(fā)生重構以代償心功能，在病理性刺激持續(xù)存在的情況下，心臟功能向失代償轉變，最終發(fā)展成為心力衰竭［1］.心力衰竭的預后非常差，5年病死率高達50%以上，嚴重威脅人類健康，被認為是“心血管疾病中尚未攻克的堡壘”.由于成年心肌細胞通常不能再生，心臟移植成為治療重型心力衰竭的唯一有效途徑.但由于心臟供體的嚴重匱乏，成千上萬的心力衰竭患者在等待中死亡.而干細胞具有增殖和分化潛能，是器官發(fā)育和組織修復的基礎.尋找合適的干細胞類型，促進心肌再生，有效改善心功能是心肌再生治療領域的研究熱點.

1　骨髓干細胞與心肌再生

在所有干細胞類型中，骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）促進心肌再生的相關研究最早.MSC最初在骨髓中被發(fā)現(xiàn)，在體內或體外特定誘導條件下，可分化成多種組織細胞包括心肌及內皮等［2］.由于MSC來源廣、易培養(yǎng)，具有較強的分化潛能和可以自體移植等優(yōu)點，為各種心肌細胞壞死性疾病提供了一條新的有效的治療途徑，被認為是即將引入臨床治療的最優(yōu)干細胞.國際上將骨髓干細胞移植用于治療心肌梗死始于2001年［3］.除急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）外，其他心臟疾病如陳舊性心肌梗死、重癥心絞痛、嚴重心肌病以及由各種原因引起的心力衰竭等也都涉及心肌細胞的壞死，同樣可以施行自體骨髓干細胞移植治療［3］.

臨床試驗結果表明，冠脈內骨髓干細胞移植可改善急性心肌梗死后左室收縮舒張功能及冠脈血流儲備［4］.復旦大學附屬中山醫(yī)院臨床研究也證實，同種異體骨髓MSC對急性心肌梗死的心功能改善起到積極的作用，對慢性心梗病人的治療雖然沒有提高心臟的左室收縮功能，卻能改善舒張功能.不過MSC移植后存活率低等問題嚴重影響其對心功能的改善效果.復旦大學附屬中山醫(yī)院的臨床團隊嘗試多次冠脈內注射MSC，觀察到多次注射比單次注射對大面積心梗的心功能恢復作用更明顯［5］，并且觀察到急性心梗后4～7 d是最佳移植時間，能夠明顯降低再次血運重建率、死亡或再次心肌梗死的聯(lián)合發(fā)生率等［4］.這主要是因為處于這個時間窗的心肌彈性可能更有利于移植細胞的存活和分化［6］，心臟微環(huán)境對移植后MSC在體內的存活及分化有重要的作用.

盡管MSC移植治療心梗是非常有臨床價值的，但其具體機制并不十分清楚.有學者認為，除了MSC分化成心肌細胞或血管細胞等細胞外，其通過旁分泌作用修復心肌或促進血管新生也產生一定的作用［7］.因此，探索MSC移植促進心肌再生及改善心功能的機制，采用多種手段協(xié)同改善MSC的存活及分化，有利于突破MSC移植效率低的瓶頸，從而更有效地治療心梗后心衰.

2　心臟側群干細胞與心肌再生

側群（side population，SP）細胞是一種特殊類型的干/祖細胞，最初是1996年Goodell等［2］在分離純化小鼠骨髓造血干細胞時分離和鑒定出的，其發(fā)育和分化狀態(tài)可能介于胚胎和成體干細胞之間，仍具有很強的多向分化潛能和增殖特性，能參與相應組織的更新與再生.由于SP細胞具有將熒光染料Hoechst 33342泵出細胞外的特性，利用這一特性并結合熒光激活細胞分選法可對SP細胞進行分離純化，且因其在流式二維分析點陣圖上呈彗星狀分布在造血干/祖細胞主群的一側，因此被稱為SP細胞.自2002年以來，不斷有證據(jù)表明，心臟中也含有SP細胞，即心臟側群細胞（cardiac side population cells，CSPs）.CSPs具有干細胞特性，表達一些干細胞的標志，如Sca-1，Mdr1，c-kit等，因此CSPs細胞實際是心臟成體干細胞的集合，是研究心臟原位修復的重要方向［8］.

CSPs具有干細胞的特點，能夠增殖形成克隆并分化為心肌細胞、內皮細胞、脂肪組織等多種細胞類型［9-10］.在生理狀態(tài)下CSPs維持極低水平的增殖更新，發(fā)生心肌梗死后，SP細胞的增殖水平快速提高，然后逐步降低.已有研究表明，心梗后心臟中有一部分來自骨髓中的SP細胞駐留心臟，轉化為CSPs［11］，提示CSPs的增多有可能對修復心肌有重要作用.然而在各種病因所致的心肌損傷中，心肌再生和修復還是有很大的局限性.究竟是CSPs更新水平不夠、數(shù)量有限，還是缺乏合適的微環(huán)境介導CSPs的增殖分化從而導致心肌損傷的不可逆發(fā)生？這些問題都有待進一步研究.

本研究團隊試圖找到激活CSPs，喚起心臟的自我修復能力的方法.前期研究觀察到粒細胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）還可以直接活化心肌細胞STAT3信號抑制心肌細胞凋亡［12］.已有研究表明，G-CSF能夠促使骨髓干細胞向損傷的心臟趨化成為CSPs，發(fā)揮修復心肌的作用［13］.因此，G-CSF被看作有潛力治療心肌梗死的藥物而進入臨床試驗階段.另外，本研究團隊在CSPs表面還發(fā)現(xiàn)UrotensinⅡ（UⅡ）受體的存在.與G-CSF受體不同，UⅡ受體的活化并不能促進CSPs的增殖能力，而是通過活化JNK信號通路抑制其增殖能力［14］.在壓力超負荷小鼠的心衰模型中，觀察到血清中UⅡ明顯上升，使用Urantide阻斷UⅡ受體能夠促進壓力超負荷小鼠CSPs增殖，提高心臟修復能力，改善心臟功能［15］.因此，如何制定最佳藥物組合，促進CSPs增殖和分化，最大程度地提升心臟自我修復潛力將是未來的研究方向.

3　誘導多能干細胞與心肌再生

2006年Takahashi等［16］通過特定基因的表達將完全分化的成年細胞重新編程為類似胚胎狀態(tài)的全能性或多能性的細胞，即誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）.由于iPSCs可由體細胞直接轉化而來，具有來源廣泛、取材便捷、免疫相容性高等優(yōu)點，并且其生理特性接近胚胎干細胞，是研究組織再生包括心肌再生的重要工具.iPSCs技術也被認為是干細胞研究領域的一個里程碑式的突破，具有巨大的潛在應用價值.

但要真正將iPSCs應用于臨床治療心血管疾病，還需先解決以下幾個問題：①iPSCs自發(fā)向心肌細胞分化的效率極低，并且分化后的功能不成熟；②iPSCs有成瘤性的風險，因此需要研究iPSCs向心肌細胞高效分化的機制，建立穩(wěn)定的定向分化技術體系，并盡可能篩選純化心肌細胞以進行移植，避免直接iPSCs治療可能引發(fā)的腫瘤風險.

各研究團隊大多通過化學小分子預處理或者直接導入心肌分化相關基因促使iPSCs向心肌細胞分化［17-18］.本研究團隊利用蛋白組學技術，分析了二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）誘導P19CL6細胞向心肌細胞分化的不同時間點的表達蛋白譜差異，從中篩選出重要調節(jié)因子——核小體組裝蛋白類似蛋白1（nucleosome assembly protein 1-like 1，Nap1L1）［19］. Nap1L1是一種核小體組裝蛋白，參與DNA復制和核小體組裝，并且能促進細胞包括iPSCs的增殖［20-21］.本研究團隊分別構建了Nap1L1敲減和過表達的iPSCs系，iPSCs的多能干性并未受到影響.在相同分化培養(yǎng)條件下，下調Nap1L1表達使iPSCs向心肌細胞分化的比率增加近5倍，分化的心肌細胞具備正常心肌細胞的結構和功能特征.通過構建誘導型的Nap1L1過表達iPSCs系，明確了Nap1L1能夠調控中胚層的分化，從而調節(jié)心肌分化.同樣地，下調Nap1L1可明顯促進iPSCs向平滑肌以及內皮細胞的分化.已有研究表明，notch信號抑制可明顯促進中胚層的分化以及心肌和血管細胞的分化，進一步的研究表明Nap1L1調控中胚層及心肌分化是通過調控notch信號活性來實現(xiàn)的［22］.上述研究結果提示心肌細胞的分化是個非常復雜的過程，通過單一因素特異性地促進iPSCs向心肌分化存在很大的局限性.本研究團隊還觀察到，在心臟晚期發(fā)育過程中起重要作用的胰島素生長因子結合蛋白4（insulin-like growth factor binding protein 4，IGFBP4）也可促進iPSCs向心肌細胞分化，具體機制主要是通過抑制wnt信號β-catenin從而促進分化的心肌細胞增殖［23］.楊黃恬研究組通過11株不同的iPSCs系統(tǒng)篩選出了16種心肌細胞分化誘導物，發(fā)現(xiàn)只有抗壞血酸（ascorbic acid，AA）起到了一致和高效的誘導iPSCs向心肌細胞分化的作用.通過比較不同濃度和不同分化時段AA的處理，建立了簡單、經濟、高效的誘導iPSCs向心肌細胞分化的體系，可將小鼠和人iPSCs向心肌細胞的分化效率分別提高約7.3倍和30.2倍，并明顯縮小不同iPSCs系間包括不具有自發(fā)心肌細胞分化潛能的iPSCs間心肌細胞的分化差異［24］.

雖然iPSCs為心血管研究尤其是心肌再生提供了新的機會，但將iPSCs真正應用于臨床還存在若干問題.在了解iPSCs向心肌分化機制的基礎上，利用基因干預技術以及小分子化合物的誘導作用，協(xié)同促進iPSCs向心肌細胞分化，從而用于損傷心肌的修復，這是未來需要進一步發(fā)展的治療策略.

4　結束語

綜上所述，盡管干細胞為心肌再生提供了廣闊的應用前景，但有些問題亟待解決.2014年美澳兩國科研人員利用人類干細胞，在動物實驗中成功修復了猴子受損的心臟，實現(xiàn)了心肌再生，為推動相關技術早日進入臨床試驗階段帶來新的希望.而如何通過基因及化學藥物技術最大程度地提高移植細胞的存活率，使各類干細胞發(fā)揮自身優(yōu)勢促進人類心臟損傷后的心肌再生，是干細胞研究者們正在努力的目標.

［1］COLUCCI W S.Molecular and cellular mechanisms of myocardial failure［J］.Am J Cardiol，1997，80：15L-25L.

［2］GOODELL M A，BROSE K，PARADIS G，et al.Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo［J］.J Exp Med，1996，183（4）：1797-1806.

［3］PITTENGER M F，MARTIN B J.Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics［J］.Circ Res，2004，95（1）：9-20.

［4］ZHANG S，SUN A，XU D，et al.Impact of timing on efficacy and safety of intracoronary autologous bone marrow stem cells transplantation in acute myocardial infarction：a pooled subgroup analysis of randomized controlled trials［J］.Clin Cardiol，2009，32（8）：458-466.

［5］YAO K，HUANG R，SUN A，et al.Repeated autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with large myocardial infarction［J］.Eur J Heart Fail，2009，11（7）：691-698.

［6］ZHANG S，MA X，YAO K，et al.Combination of CD34-positive cell subsets with infarcted myocardium-like matrix stiffness：a potential solution to cell-based cardiac repair［J］.J Cell Mol Med，2014，18（6）：1236-1238.

［7］HU X，XU Y，ZHONG Z，et al.A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates：paracrine activity without remuscularization［J］.Circ Res，2016，118（6）：970-983.

［8］NAGAI T，MATSUURA K，KOMURO I.Cardiac side population cells and Sca-1-positive cells［J］. Methods Mol Biol，2013，1036：63-74.

［9］LIANG S X，TAN T Y，GAUDRY L，et al.Differentiation and migration of Sca1+/CD31-cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model［J］.Int J Cardiol，2010，138（1）：40-49.

［10］OYAMA T，NAGAI T，WADA H，et al.Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo［J］.J Cell Biol，2007，176（3）：329-341.

［11］MOUQUET F，PFISTER O，JAIN M，et al.Restoration of cardiac progenitor cells after myocardial infarction by self-proliferation and selective homing of bone marrow-derived stem cells［J］.Circ Res，2005，97（11）：1090-1092.

［12］MA H，GONG H，CHEN Z，et al.Association of Stat3 with HSF1 plays a critical role in G-CSF-induced cardio-protection against ischemia/reperfusion injury［J］.J Mol Cell Cardiol，2012，52（6）：1282-1290.

［13］ADACHI Y，IMAGAWA J，SUZUKI Y，et al.G-CSF treatment increases side population cell infiltration after myocardial infarction in mice［J］.J Mol Cell Cardiol，2004，36（5）：707-710.

［14］GONG H，MA H，LIU M，et al.UrotensinⅡinhibits the proliferation but not the differentiation of cardiac side population cells［J］.Peptides，2011，32（5）：1035-1041.

［15］CHEN Z，XU J，YE Y，et al.UrotensinⅡinhibited the proliferation of cardiac side population cells in mice during pressure overload by JNK-LRP6 signaling［J］.J Cell Mol Med，2014，18（5）：852-862.

［16］TAKAHASHI K，YAMANAKA S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.Cell，2006，126（4）：663-676.

［17］DENNING C，BORGDORFF V，CRUTCHLEY J，et al.Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells：from laboratory curiosity to industrial biomedical platform［J］.Biochim Biophys Acta，2015，DOI：10.1016/j.bbamcr.2015.10.014.

［18］DEN HARTOGH S C，PASSIER R.Concise review：fluorescent reporters in human pluripotent stem cells：contributions to cardiac differentiation and their applications in cardiac disease and toxicity［J］.Stem Cells，2016，34（1）：13-26.

［19］LI L，GONG H，YU H，et al.Knockdown of nucleosome assembly protein 1-like 1 promotes dimethyl sulfoxide-induced differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes［J］.J Cell Biochem，2012，113（12）：3788-3796.

［20］PARK Y J，LUGER K.Structure and function of nucleosome assembly proteins［J］.Biochem Cell Biol，2006，84：549-558.

［21］YAN Y，YIN P，GONG H，et al.Nucleosome assembly protein 1-like 1（Nap1l1）regulates the proliferation of murine induced pluripotent stem cells［J］.Cell Physiol Biochem，2016，38（1）：340-350.

［22］GONG H，YAN Y，F(xiàn)ANG B，et al.Nucleosome assembly protein 1-like 1 knockdown promotes cardiomyocytes differentiation by mesoderm induction through notch signaling in mouse induced pluripotent stem cells［J］.Stem Cells，2014，32（7）：1759-1773.

［23］XUE Y，YAN Y，GONG H，et al.Insulin-like growth factor binding protein 4 enhances cardiomyocyte induction in mouse induced pluripotent stem cells［J］.J Cell Biochem，2014，115（9）：1495-1504.

［24］CAO N，LIU Z，CHEN Z，et al.Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells［J］.Cell Res，2012，22（1）：219-236.

Stem cells and cardiac regeneration

GONG Hui，CHEN Zhidan，ZOU Yunzeng
（Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases，Zhongshan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China）

Human myocardium has poor regenerative power，and significant myocardial injury results in irreversible damage，remodeling，and dysfunction.Stem cells enable promising regenerative strategies for cardiovascular diseases.The search for suitable stem cell phenotypes that will improve myocardial regenerative ability needs better understanding of the molecular mechanisms of repair and regeneration.Previous reports have suggested that several stem phenotypes regulate myocardial regeneration in vitro and in vivo. This review describes the therapeutic potential of mesenchymal stem cell（MSC）therapy in terms of angiogenic and regenerative capacity after myocardial infarction.In addition，the effect of cardiac side population cells（CSPs）and the differentiation of induced pluripotent stem cells（iPSCs）in cardiac regeneration are discussed.The review provides recent data and helps broaden therapeutic potential and clinical impact of stem cell therapy.

stem cell；cardiac regeneration；mesenchymal stem cell（MSC）；cardiac side population cells（CSPs）；induced pluripotent stem cells（iPSCs）

R 34

A

1007-2861（2016）03-0280-05

10.3969/j.issn.1007-2861.2016.03.016

2016-04-20

國家自然科學基金資助項目（81370258）；上海市科委資助項目（13JC1401703）

龔惠（1975—），女，副研究員，研究方向為干細胞和心力衰竭.E-mail：ghui1975@163.com