石月萍，楊關(guān)林

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032)

栝樓薤白半夏湯預(yù)處理保護(hù)缺血再灌注大鼠心肌PI3K/Akt通路機制*

石月萍，楊關(guān)林△

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032)

目的:研究栝樓薤白半夏湯預(yù)處理對缺血再灌注大鼠心肌組織的保護(hù)作用及其機制是否與PI3K/Akt信號通路相關(guān)。方法:40只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、預(yù)處理組、栝樓組。模型組及栝樓組大鼠行結(jié)扎冠狀動脈左前降支30 min、再灌注2 h的方法造模，并設(shè)預(yù)處理組為對照。預(yù)處理組造模方法為短暫缺血5 min、再灌注5 min，反復(fù)3次后行缺血30 min、再灌注120 min。栝樓組給予中藥湯劑栝樓薤白半夏湯灌胃，其余各組灌胃同體積的生理鹽水。生化自動儀檢測大鼠血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、cTnT(肌鈣蛋白T)含量;采用免疫組化法檢測心肌凋亡相關(guān)蛋白 bax、bcl-2表達(dá)情況，采用免疫印跡法檢測心肌組織的Akt、p-Akt表達(dá)。結(jié)果:栝樓組和預(yù)處理組血清CK-MB、LDH、cTnT含量及心肌組織的bax蛋白表達(dá)低于模型組，而bcl-2、p-Akt蛋白表達(dá)高于模型組。結(jié)論:栝樓薤白半夏湯預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，通過激活PI3K/Akt信號通路，與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax蛋白的表達(dá)有關(guān)。

缺血再灌注損傷;栝樓薤白半夏湯;Akt;bcl-2;bax

隨著冠脈介入治療技術(shù)的廣泛開展，閉塞的冠狀動脈開通后血流得以重建，而隨之而來的再灌注可以導(dǎo)致心肌的損傷。缺血預(yù)適應(yīng)是減輕心肌缺血再灌注損傷最為有效的方法，近年來藥物預(yù)適應(yīng)已經(jīng)成為防治心肌缺血再灌注損傷的研究熱點［1］。目前的研究顯示，許多中藥的復(fù)方及單方制劑可以減輕缺血再灌注損傷［2］。栝樓薤白半夏湯［3］、枳實薤白桂枝湯［4］以及以枳實薤白桂枝湯加減的溫陽通脈方，均可以減輕心肌缺血再灌注損傷［5］，并通過多種機制發(fā)揮心肌保護(hù)作用［6-7］。多條信號通路參與缺血再灌注損傷機制，其中RISK途徑的PI3K/ Akt通路參與缺血及藥物預(yù)處理及后處理對再灌注損傷的保護(hù)作用［8］。栝樓薤白半夏湯的心肌保護(hù)作用，是否與PI3K/Akt通路調(diào)節(jié) bax、bcl-2相關(guān)尚無報道。本研究擬觀察栝樓薤白半夏湯是否通過PI3K/Akt調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2機制參與心肌再灌注損傷的保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

40只雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購于遼寧醫(yī)學(xué)院實驗雄性動物中心，按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、預(yù)處理組、栝樓組(栝樓薤白半夏湯)4組各10只。

1.2 藥品與試劑

栝樓薤白半夏湯方由栝樓、薤白、半夏等組成，采用免煎配方顆粒，北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供(批號14006951)。肌酸激酶同工酶檢測試劑盒、乳酸脫氫酶檢測試劑盒、肌鈣蛋白定量檢測試劑盒購于德國羅氏診斷有限公司;Rabbit anti-Akt，Rabbit anti-p-Akt，Bcl-2、Bax單克隆抗體，山羊抗兔 IgG抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白測定試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司;DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供。

1.3 實驗儀器

小動物呼吸機(DH150)由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠生產(chǎn);監(jiān)護(hù)儀(BSM-7105)光電醫(yī)用電子公司生產(chǎn);全自動生化分析儀(HITACHI7080)購于日本HITACHI7080公司;超薄切片機(EMC6型)購于LEICA公司;全自動免疫組化染色儀購于美國DAKOCYTOMSTION;光學(xué)顯微鏡購于日本奧林帕斯;TGL-16G低溫冷凍離心機購于日本日立公司;垂直電泳槽(HE-180)、轉(zhuǎn)移電泳槽購于上海天能科技有限公司。

1.4 模型制備及給藥

按照文獻(xiàn)方法采用左前降支結(jié)扎的方法制備模型［9］，采用腹腔注射烏拉坦(1 g/kg)麻醉大鼠，將麻醉后的大鼠仰臥固定于小動物解剖臺固定四肢，插入針形電極，連接好心電圖監(jiān)測儀，全程記錄Ⅱ?qū)碾妶D。篩選正常心電圖的大鼠進(jìn)行氣管插管操作，連接小動物呼吸機，進(jìn)行人工機械通氣。胸部皮膚消毒備皮，用手術(shù)剪刀從左側(cè)胸部剪開皮膚分離胸部肌肉，第四肋處剪開胸腔暴露心臟，剪開心包膜，在左心耳部下方約2 mm處穿進(jìn)6-0帶線縫合針，穿過心肌表層，在肺動脈圓錐的旁邊出針，將直徑1.5 mm的硅膠管放在結(jié)扎線與冠狀動脈左前降支血管之間。系緊結(jié)扎線時，左前降支血管受到硅膠管壓迫而致冠狀動脈閉塞，松開結(jié)扎線時血管再通。模型組、GL組結(jié)扎30 min，松開結(jié)扎線以使血流開通120 min。預(yù)處理組結(jié)扎左前降支5 min，松開結(jié)扎線，再灌注 5 min，此種方式重復(fù)3次，再進(jìn)行缺血30 min，再灌注120 min。假手術(shù)組只進(jìn)行開胸，并在冠狀動脈處完成穿線，但不結(jié)扎冠狀動脈。

模型制備前栝樓組灌胃栝樓薤白半夏湯 1.5 ml/d免煎中藥配方顆粒(栝樓薤白半夏湯配伍比例為4∶3∶3，2.7 g/kg)，其他組灌胃生理鹽水1.5 ml/d連續(xù)2周。缺血再灌注損傷模型成功的標(biāo)志為左前降支結(jié)扎后可見左心室顏色發(fā)紺，心電圖S-T段抬高。再灌注血流后，心肌顏色由發(fā)紺轉(zhuǎn)紅，伴有心律失常發(fā)生。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 血清心肌酶學(xué)檢測 實驗完成后大鼠無死亡，再灌注120 min后左心室取血，采用生化分析儀酶比色法檢測CK-MB、LDH、cTnT。

1.5.2 心肌組織 p-Akt蛋白檢測 采用免疫印跡法檢測p-Akt蛋白含量。取缺血區(qū)心肌組織稱取100 mg，加入1 ml裂解液，勻漿器置冰上研磨組織，勻漿后12000 r/min、4℃離心10 min，吸取上清液，BCA試劑盒測定蛋白含量，蛋白變性，上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的 TBS中37℃封閉120 min，加一抗4℃封閉過夜，TBS-T液洗滌3次，加二抗37℃孵育120 min，TBS-T洗滌3次后濾干，暗室內(nèi)加入發(fā)光液后曝光30 min，掃描圖像分析各組蛋白的相對光密度值。

1.5.3 心肌組織bax、bcl-2檢測 采用免疫組織化學(xué)法檢測。造模后取缺血部位心肌組織，4%多聚甲醛固定制作石蠟切片。心肌組織蠟片經(jīng)6 h溫箱烤片，常規(guī)脫蠟，PBS液沖洗3次。切片置枸櫞酸鹽緩沖液中，140℃微波加熱5 min，待冷卻后再次沖洗。用3%的過氧化氫孵育5 min沖洗，加入1∶100稀釋的 bax、bcl-2一抗，濕盒內(nèi)4℃冰箱內(nèi)過夜，沖洗后的切片再加入生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育，20 min后沖洗DAB顯色3～5 min。再水洗經(jīng)蘇木素復(fù)染，酒精脫水后二甲苯透明，樹脂封片后顯微鏡下觀察Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。細(xì)胞漿染成棕黃色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞核數(shù)與細(xì)胞核總數(shù)比值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計量資料采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌酶學(xué)及心肌組織p-Akt、bax、bcl-2表達(dá)(表1)

表1 大鼠血清CK-MB、LDH、cTnT含量及心肌p-Akt、bax、bcl-2的表達(dá)(±s)

表1 大鼠血清CK-MB、LDH、cTnT含量及心肌p-Akt、bax、bcl-2的表達(dá)(±s)

注:與假手術(shù)組比較:△P＜0.05;與模型組比較:☆P＜0.05

p-Akt bax bcl-2假手術(shù)組 10 555.70±101.92 368.94± 72.17 1.37±0.20 0.5組 別 鼠數(shù) CK-MB(U/L) LDH(U/L) cTnT(μg/L) 2±0.12 0.21±0.08 0.25±0.07模 型 組 10 1902.44±256.21△ 1483.93±208.91△ 8.85±2.50△ 0.68±0.14△ 0.79±0.13△ 0.41±0.09△預(yù)處理組 10 1473.07±158.26△☆ 1185.59±107.60△☆ 5.25±1.65△☆ 1.14±0.17△☆ 0.35±0.09△☆ 0.65±0.11△☆栝 樓 組 10 1508.95±175.53△☆ 1171.47±127.43△☆ 5.15±1.58△☆ 1.22±0.27△☆ 0.36±0.10△☆ 0.66±0.14△☆

2.2 各組大鼠心肌組織p-Akt表達(dá)(圖1)

2.3 大鼠心肌組織bax、bcl-2蛋白表達(dá)

圖1 各組大鼠心肌組織p-Akt表達(dá)

圖2 各組大鼠心肌bax表達(dá)(×400)

圖2 顯示，與假手術(shù)組比較，模型組心肌細(xì)胞Bax表達(dá)明顯增多，預(yù)處理組及栝樓組 Bax表達(dá)有所減少。

圖3 各組大鼠心肌Bcl-2表達(dá)(×400)

圖3 顯示，與假手術(shù)組比較，模型組心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯減少，預(yù)處理組及栝樓組Bax表達(dá)有所增加。

3 討論

冠脈介入治療時出現(xiàn)的心肌缺血再灌注損傷證候應(yīng)類似于中醫(yī)學(xué)的“胸痹心痛”。栝樓薤白半夏湯方為《金匱要略》治療胸痹心痛的方劑，具有行氣化痰、宣痹通陽的功效。臨床實踐及實驗研究均表明，栝樓薤白半夏湯具有心臟保護(hù)作用［3］。

研究表明，冠脈介入治療后，血管開通伴隨的心肌缺血再灌注損傷的機制包括氧化應(yīng)激、鈣超載、炎癥損傷、細(xì)胞凋亡等。動物實驗觀察到，缺血預(yù)適應(yīng)是心肌缺血再灌注損傷最重要也是最為有效的內(nèi)源性保護(hù)機制［9］。線粒體途徑為凋亡機制之一［10］，其中PI3K(磷脂酰肌醇3激酶)/Akt(蛋白激酶B)通路為缺血再灌注損傷的主要抗凋亡通路，Akt被認(rèn)為是復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)信號通路的中心調(diào)節(jié)器。Bcl-2為Akt底物之一，Bcl-2能與線粒體上的特異位點相結(jié)合，抑制線粒體細(xì)胞色素C釋放，降低Caspase-3活性，抑制細(xì)胞凋亡［11-12］。

中藥單方復(fù)方對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用已有報道，但是否具有藥理性預(yù)適應(yīng)樣作用以及具體的保護(hù)機制尚不明確［13］。

本實驗觀察了栝樓薤白半夏湯預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌壞死標(biāo)記物CK-MB、LDH、cTnT含量與 PI3k/Akt及其下游抗凋亡分子 bax、Bcl-2的影響。研究結(jié)果顯示，模型組的 CK-MB、LDH、cTnT明顯高于假手術(shù)組，說明缺血再灌注損傷模型成功。與模型組比較，預(yù)處理組和栝樓組的CK-MB、LDH、cTnT均明顯下降，說明預(yù)處理和栝樓薤白半夏湯對缺血再灌注損傷均具有保護(hù)作用。

觀察到栝樓組及預(yù)處理組大鼠心肌組織中bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯增加，bax蛋白表達(dá)減少，說明栝樓薤白半夏湯與心肌缺血預(yù)適應(yīng)均可明顯抑制心肌缺血再灌注后心肌組織中bax蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)。免疫印跡方法檢測各組Akt、p-akt的結(jié)果顯示，各組akt表達(dá)量無差異，而p-Akt的表達(dá)各組有差異，表明 p-Akt的變化是缺血再灌注損傷及栝樓薤白半夏湯的作用靶點。假手術(shù)組僅有少量p-akt表達(dá)，模型組略有升高，說明機體受到缺血刺激后p-akt表達(dá)增加。預(yù)處理組 p-akt表達(dá)明顯增加，說明預(yù)處理可激發(fā)Akt磷酸化發(fā)揮調(diào)節(jié)作用;栝樓組及預(yù)處理組p-akt表達(dá)明顯增多，2組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明栝樓薤白半夏湯能夠通過Akt磷酸化發(fā)揮心肌保護(hù)作用，與心肌缺血預(yù)適應(yīng)的作用類似。以上結(jié)果說明，預(yù)處理組通過缺血前的預(yù)處理使p-Akt、bcl-2蛋白表達(dá)增加，而栝樓薤白半夏湯通過模擬心肌缺血預(yù)適應(yīng)上調(diào) p-Akt、bcl-2表達(dá)發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明，栝樓薤白半夏湯能夠降低心肌壞死標(biāo)記物的含量，上調(diào)心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞p-Akt、bcl-2，降低bax蛋白表達(dá)，說明栝樓薤白半夏湯對大鼠急性心肌缺血引起的心肌損傷具有保護(hù)作用，其機制可能與預(yù)適應(yīng)樣作用通過 PI3K/ Akt途徑上調(diào)bcl-2、抑制bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

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Evaluation Research of Saliva Collection Method in Rat Model of Spleen Deficiency by Using Salivary Amylase Activity Index

SHI Yue-ping，YANG Guan-lin△
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，liaoning，Shenyang，110032，China)

Objective:To study the effects of Gualou Xiebai Banxia Decoction on rats with myocardial ischemia/ reperfusion injury and PI3K/Akt mechanism.Methods:Forty male SD rats were randomly divided into sham operation group，model(ischemia reperfusion)group，ischemia preconditioning group，Gualou Xiebai Banxia decoction(Gualou) group.The model group were established by ligation of LAD 30 minutes and 120 minutes reperfusion.Gualou group were established by ischemia reperfusion model and previous three 5 minutes ischemia and 5 minutes reperfusion.Creatine kinase MB Isoenzyme(CK-MB)，lactate dehydrogenase(LDH)and Troponin T(cTnT)in serum were measured.The expression of the bax and bcl-2 was tested by immunohistochemistry method.The expression of Akt was tested by Western blot method.Results:The serum level of CK-MB，LDH，cTnT and bax in myocardium of ischemia preconditioning and GuaLou group were lower than model group，but higher than sham group.The expression level of Akt and bcl-2 in myocardium ischemia preconditioning and GuaLou group were higher than IR group.Conclusion:Gualou Xiebai Banxia decoction preconditioning can protect ischemia reperfusion rats by uploading the expression of bcl-2 and download the expression of bax via PI3K/Akt signal pathway.

Myocardial ischemic reperfusion;Ischemic preconditioning;Gualou Xiebai Banxia decoction;Akt;Bcl-2;Bax

R285.5

:B

:1006-3250(2016)07-0906-03

2016-01-27

遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(201102128)-溫陽通脈法保護(hù)心肌缺血再灌注大鼠RISK通路機制

石月萍(1968-)，女，遼寧鞍山人，主任醫(yī)師，教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)藥防治心血管疾病的臨床與研究。

△通訊作者:楊關(guān)林，教授，博士研究生導(dǎo)師，Tel:024-31207046，E-mail:yang_guanlin@163.com。