郭正陽，倪祥惠，趙 博，黃 聰，吳大梅，吳 菁，林川烘，潘雷文

(貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴陽 550002)

肝主疏泄功能對(duì)模型動(dòng)物SRBⅠ基因mRNA表達(dá)的影響*

郭正陽，倪祥惠△，趙 博，黃 聰，吳大梅，吳 菁，林川烘，潘雷文

(貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴陽 550002)

目的:觀察肝主疏泄功能對(duì)模型動(dòng)物肝臟SRBⅠ基因mRNA表達(dá)的影響。方法:將健康雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、CUMS組和單純束縛組，采用孤養(yǎng)結(jié)合CUMS以及單純束縛造模方法建立肝失疏泄動(dòng)物模型，實(shí)時(shí)熒光定量TaqMan探針法檢測肝臟組織內(nèi)SRBⅠ基因mRNA的表達(dá)量并觀察其變化規(guī)律。結(jié)果:與正常組比較，CUMS組和單純束縛組大鼠肝臟SRBⅠ基因mRNA的表達(dá)量均增高。結(jié)論:肝主疏泄功能的失常會(huì)在一定程度上影響模型動(dòng)物SRBⅠ基因的表達(dá)，在某種肝失疏泄?fàn)顟B(tài)下SRBⅠ基因的mRNA表達(dá)呈升高趨勢。

肝主疏泄;慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激;單純束縛應(yīng)激;膽固醇性膽結(jié)石;SRBⅠ基因

膽固醇性膽結(jié)石是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病與多發(fā)病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇性膽結(jié)石形成的首要原因是肝臟膽固醇代謝異常引起的膽汁中膽固醇過飽和，且與遺傳因素密切相關(guān)。膽固醇性膽結(jié)石屬于中醫(yī)學(xué)“膽脹”“脅痛”“腹痛”“黃疸”等范疇，其發(fā)病主要與肝的疏泄功能有關(guān)。本文以孤養(yǎng)結(jié)合 CUMS(慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激，chronic unpredictable mild stress)以及單純束縛為造模方法，模擬肝失疏泄的動(dòng)物模型，從SRBⅠ基因入手，觀察肝主疏泄功能對(duì)SRBⅠ基因mRNA表達(dá)的影響，為“膽病從肝論治”提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量170 g～190 g，購于解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK-(軍)2012-0003)。

1.2 試劑

RNA抽提試劑盒(批號(hào) CW0581)由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)4368814)、TaqMan?Universal Master MixⅡ，no UNG、2X(批號(hào)4428174)、SRBⅠ基因(1201313)以及管家基因Gapdh(1239726)均由applied biosystems公司提供。

1.3 儀器

ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀、eppendorf臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(5810R)、超微量核酸蛋白檢測儀(Thermo Scientific)、電動(dòng)勻漿機(jī)、酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、－80℃冰箱。

1.4 動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、CUMS組和單純束縛組3組各12只。

1.5 孤養(yǎng)結(jié)合CUMS模型的復(fù)制

每只CUMS組大鼠均進(jìn)行單籠孤養(yǎng)。CUMS模型的制備在金光亮等［1］提出的造模方法基礎(chǔ)上根據(jù)自身實(shí)際情況進(jìn)行操作，將7種刺激(4℃冷水游泳5 min;45℃熱刺激5 min;12 h禁水;24 h禁食;12 h晝夜顛倒;行為限制;45 min無規(guī)則水平搖晃)隨機(jī)安排在21 d內(nèi)，每天隨機(jī)2種，并保證相鄰2 d不重復(fù)同一種刺激。本組動(dòng)物于造模開始第2天意外死亡3只，將正常組動(dòng)物補(bǔ)入CUMS組3只。

1.6 單純束縛模型的復(fù)制

參考黃聰?shù)龋?］文獻(xiàn)中提到的造模方法，使用鼠籠加報(bào)紙?zhí)钊ㄏ拗拼笫蠡顒?dòng)(3 h/d)。

1.7 標(biāo)本采集

所有動(dòng)物于造模后第22天用10%水合氯醛按照0.3 ml/100 g進(jìn)行腹腔麻醉，將麻醉好的大鼠固定于鼠板上沿腹正中線切開，在劍突下方找到肝臟，取適量樣本在0.9%氯化鈉溶液中漂洗去除血污，分裝放入凍存管內(nèi)并加入適量RNA保存液，然后將所取的樣本放于－80℃冰箱中保存待測。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量 TaqMan探針法檢測肝臟SRBⅠ基因mRNA的表達(dá)

取30～50 mg肝臟組織嚴(yán)格按照試劑盒說明提取總RNA。在超微量核酸蛋白檢測儀上檢測樣品RNA含量并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。PCR擴(kuò)增: TaqMan?Universal Master MixⅡ 10 μL，TaqMan?Assay 1 μL，樣本 cDNA 1 μL，RNase-Free water 8 μL。擴(kuò)增條件:95℃ 10 min;95℃ 10 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后以2－△△CT值計(jì)算SRBⅠ基因mRNA的表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1顯示，CUMS組和單純束縛組肝臟SRBⅠ基因 mRNA的表達(dá)量均較正常組表達(dá)量增高，且CUMS組與正常組、CUMS組與束縛組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但單純束縛組與正常組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 大鼠肝臟組織SRBⅠ基因表達(dá)量(±s)

表1 大鼠肝臟組織SRBⅠ基因表達(dá)量(±s)

注:與正常組比較:※P＜0.05;與CUMS組比較:○P＜0.05

組別 例數(shù) 2－△△CT值0.6506±0.3209 CUMS 組 12 1.3849±0.6949※單 純 束 縛 組 12 0.7641±0.6081正 常 組9○

3 討論

中醫(yī)藏象理論認(rèn)為，肝具有主疏泄的生理功能，是指肝氣具有疏通、暢達(dá)全身氣機(jī)進(jìn)而調(diào)節(jié)精血津液運(yùn)行輸布、脾胃之氣升降、膽汁分泌排泄以及情志舒暢等作用。其中促進(jìn)膽汁的分泌排泄是肝疏泄功能之調(diào)節(jié)脾胃正常消化功能的主要表現(xiàn)之一。肝與膽在組織結(jié)構(gòu)上直接相連通，又有經(jīng)脈互為絡(luò)屬，為表里相合之臟腑。膽為“中精之腑”，內(nèi)藏精汁即膽汁，膽汁實(shí)為肝之余氣所化生，其排泄亦依賴于肝的疏泄功能。肝的疏泄功能正常、氣機(jī)通暢，則膽汁才能正常的分泌和排泄，反之則會(huì)影響到膽汁的正常分泌與排泄，導(dǎo)致膽汁郁滯進(jìn)而影響食物的消化吸收，若膽汁郁滯日久則易生結(jié)石。而孤養(yǎng)結(jié)合CUMS造模法和單純束縛造模法是目前常用的情志疾病造模方法，并在一定程度上能夠影響肝的疏泄功能。

膽汁中膽固醇過飽和是膽固醇性膽結(jié)石形成的首要原因。倪祥惠等［3］研究表明，通過孤養(yǎng)結(jié)合CUMS和單純束縛的造模方法所模擬的肝失疏泄動(dòng)物模型，能使膽汁中的膽固醇濃度明顯升高。而SRBⅠ(B組Ⅰ型清道夫受體，the scavenger receptor class B typeⅠ)基因作為細(xì)胞表面惟一的高密度脂蛋白受體［4］，可以通過選擇性攝取膽固醇和膽固醇脂，使膽固醇從血漿高密度脂蛋白中通過肝臟進(jìn)入膽汁，是形成膽汁中膽固醇的重要來源。有研究［5］顯示，SRBⅠ基因mRNA的表達(dá)與膽固醇性膽結(jié)石的形成密切相關(guān)。該研究認(rèn)為，若肝臟過度表達(dá)SRBⅠ基因，會(huì)使血漿高密度脂蛋白中的膽固醇通過SRBⅠ被肝臟攝取而進(jìn)入膽汁，導(dǎo)致血漿HDL膽固醇含量降低，膽汁中膽固醇濃度增加，將大大增加結(jié)石的形成幾率。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，CUMS組和單純束縛組模型動(dòng)物肝臟SRBⅠ基因mRNA的表達(dá)量均升高，其中CUMS組顯著升高，而單純束縛組相對(duì)升高不明顯，造成這一差異的原因可能是由于孤養(yǎng)結(jié)合CUMS和單純束縛這2種造模方法造成肝失疏泄?fàn)顟B(tài)的差異所引起。因此，這在一定程度上說明肝的疏泄功能失常能夠影響到肝臟中SRBⅠ基因mRNA的表達(dá)并使其升高，是形成膽固醇性膽結(jié)石的重要因素之一，這也為膽固醇性膽結(jié)石疾病選擇“膽病從肝論治”提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但肝的疏泄功能失常所造成SRBⅠ基因mRNA過度表達(dá)的具體發(fā)生機(jī)制，還有待于今后的進(jìn)一步深入研究。

［1］金光亮，南睿，郭霞珍.慢性應(yīng)激肝郁大鼠模型的建立［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26(2):18-21.

［2］黃聰，倪祥惠，曹峰，等.幾種肝郁動(dòng)物造模方法比較及鼠籠加報(bào)紙固定束縛法的效果觀察［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2014，20(11):1485-1486.

［3］倪祥惠，趙博，曹峰，等.肝主疏泄對(duì)模型動(dòng)物膽固醇濃度的影響［J］.江西中醫(yī)藥，2014，45(11):21-22.

［4］洪智賢，何小東.膽囊結(jié)石成因研究進(jìn)展［J］.消化外科，2006，5(6):479-482.

［5］Kosters A，Jirsa M，Groen AK.Genetic background of cholesterol gallstone disease［J］.Biochim Biophys Acta，2003，1637(1):1-19.

Effect of Liver Controlling Dispersion on the Expression of SRBⅠGene mRNA in the Animal Model

GUO Zheng-yang，NI Xiang-hui△，ZHAO Bo，HUANG Cong，WU Da-mei，WU Jing，LIN Chuan-hong，PAN Lei-wen
(Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，China)

Objective:The effects of Liver controlling dispersion on the model animal’s gene expression in mRNA of SRBⅠdiscussed through the observation of change of the model animal’s mRNA expression of SRBⅠunder Liver not freely distributing conditions.Methods:We select healthy male SD Rats and divide as Normal group，Chronic Unpredictable Mild Stress(CUMS)group and Chronic Restraint Stress(CRS)group.Then we use raising alone combining CUMS and CRS method making model to stimulate SD Rats，and then take the liver tissue to detect the gene expression of SRBⅠ by Real-Time TaqMan PCR，so as to observe their change law.Results:Compared with normal group，the gene expression of SRBⅠ of CUMS group and CRS group had increased.Conclusion:When the function of Liver controlling dispersion is abnormal，it can affect the model animal’s gene expression in mRNA of SRBⅠ in certain cases.Besides，the gene expression in mRNA of SRBⅠ can tend to increase under some not Liver freely distributing conditions.

Liver controlling dispersion;Chronic unpredictable mild stress;Chronic restraint stress;Cholesterol gallstone;SRBⅠgene

R223

:B

:1006-3250(2016)07-0904-02

2016-01-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160418)-肝主疏泄功能對(duì)模型動(dòng)物膽汁膽固醇濃度、總膽汁酸濃度和 BSEP、SRBⅠ基因表達(dá)的影響;貴州省科技廳、貴陽中醫(yī)學(xué)院聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(黔科合中藥字［2010］LKZ7015號(hào))-肝主疏泄功能對(duì)模型大鼠膽汁中膽固醇濃度的影響

郭正陽(1990-)，男，河南許昌人，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究。

△通訊作者:倪祥惠(1968-)，男，山東滕州人，教授，醫(yī)學(xué)碩士，碩士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)基礎(chǔ)理論的教學(xué)、科研與臨床研究，Tel:13608567815，E-mail:plkmnxh@163.com。