孫曉萍，周 軍，常秀娟，王振中，蕭 偉△

(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001;2.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001;3.江蘇省企業(yè)院士工作站，江蘇 連云港 222001)

【實(shí)驗(yàn)研究】

不同復(fù)合因素誘導(dǎo)對(duì)氣虛血瘀模型建立的影響*

孫曉萍1，2，3，周 軍1，2，3，常秀娟1，2，3，王振中1，2，3，蕭 偉1，2，3△

(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001;2.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001;3.江蘇省企業(yè)院士工作站，江蘇 連云港 222001)

目的:對(duì)不同復(fù)合因素誘導(dǎo)的氣虛血瘀模型進(jìn)行研究，探討模型建立的要點(diǎn)。方法:采用復(fù)合因素誘導(dǎo)方法造模，其中限食加強(qiáng)迫游泳為第1種復(fù)合因素造模方法，限食、強(qiáng)迫游泳加皮下注射腎上腺素為第2種復(fù)合因素造模方法，考察2種造模方法對(duì)不同性別大鼠體征及微觀指標(biāo)影響的差別。結(jié)果:與正常組比較，2種造模方法均使大鼠體質(zhì)量減輕，耐疲勞時(shí)間減少，免疫功能降低，全血黏度增加，內(nèi)皮功能紊亂。與第1種方法比較，第2種方法造模后大鼠耐疲勞時(shí)間、體質(zhì)量及胸腺指數(shù)下降更為明顯。與雌性大鼠比較，雄性大鼠耐疲勞時(shí)間長(zhǎng)，胸腺及脾臟指數(shù)偏小，IL-4、IFN及VEGF水平偏低。結(jié)論:2種造模方法都可成功形成氣虛血瘀證，皮下注射腎上腺素后雄性大鼠對(duì)其反應(yīng)更為敏感。建議在采用該方法造模時(shí)雌雄分開，或使用單一性別，此外在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同性別SD大鼠具有免疫差異，且血清VEGF水平也有顯著差異。

氣虛血瘀模型;限食;強(qiáng)迫游泳;鹽酸腎上腺素;性別;

氣虛血瘀模型作為證候動(dòng)物模型，已運(yùn)用到腦血管病、腎病、心臟病、肺病、胃病的氣虛血瘀證模型中［1-2］，用于從中醫(yī)病因病機(jī)角度闡釋中藥對(duì)機(jī)體的作用機(jī)理，同時(shí)常采用微觀和宏觀指標(biāo)闡明疾病過(guò)程及用藥過(guò)程中癥狀或生物標(biāo)記物質(zhì)的改變。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)［3］，以單一因素或復(fù)合因素進(jìn)行氣虛血瘀模型建立的方法不下7種，其中饑餓、疲勞和游泳因素為氣虛血瘀模型中常見的誘導(dǎo)因素，而高脂飲食、寒濕、外傷、腎上腺素、高分子右旋糖酐等因素可使機(jī)體血液呈黏滯狀態(tài)用于輔助建立血瘀證候，腎上腺素則因價(jià)格低廉、劑量及給藥方法容易掌握，建模時(shí)多采用該法。對(duì)于受試動(dòng)物的選擇，各報(bào)道也未達(dá)成一致，造模過(guò)程中更多采用雌雄兼用，但也有認(rèn)為不同性別大鼠血液流變學(xué)差異較大而使用單一性別的［4-6］。筆者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物性別及腎上腺素的使用對(duì)實(shí)驗(yàn)不同指標(biāo)具有較大影響，致使藥效結(jié)果的評(píng)價(jià)容易出現(xiàn)較大分歧，因此將以上2種因素納入考察范圍，為模型完善提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

SPF級(jí)SD大鼠雌雄兼用62只，體質(zhì)量200～220 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(合格證號(hào)SCXK(蘇)2013-0016)，按隨機(jī)數(shù)字表法分為雌性正常組、模型Ⅰ組(雌性，只執(zhí)行強(qiáng)迫游泳)、模型Ⅱ組(雌性，執(zhí)行強(qiáng)迫游泳及腎上腺素皮下注射)、雄性正常組、模型Ⅲ組(雄性，只執(zhí)行強(qiáng)迫游泳)、模型Ⅳ組(雄性，執(zhí)行強(qiáng)迫游泳及腎上腺素皮下注射)6組，每組 9～12只，大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5～6只。

1.2 試劑與儀器

鹽酸腎上腺素注射液1 mL，北京市永康藥業(yè)有限公司(批號(hào)12100241);血栓素B2(TXB2)、前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)、內(nèi)皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)、VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)、TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子)、IL-4(白介素)、IFN(干擾素)放免疫試劑盒，北京華英生物有限公司(批號(hào)20150120);水合氯醛，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

賽科希德 SA-9000全自動(dòng)血流變檢測(cè)儀;r—911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀(中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司生產(chǎn));5804R Eppendorf冷凍離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，給予充足食水，其他組大鼠限食不限水，每日攝取正常食量的1/3(每籠大鼠每日添加飼料60～70 g)［7］，第7天將所有模型組大鼠放入水深35 cm的恒溫水槽(溫度14℃ ～16℃)中游泳，當(dāng)全組 50% 的大鼠出現(xiàn)自然沉降時(shí)，全部停止游泳，如此連續(xù)游泳20 d，第26天記錄耐疲勞時(shí)間。模型Ⅱ組和模型Ⅳ組則在實(shí)驗(yàn)第16天皮下注射0.1%腎上腺素0.4 mL·kg－1，每天1次，連續(xù)10 d。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 疲勞時(shí)間測(cè)定 從大鼠入水至其自然沉降3次所需時(shí)間。

1.4.2 血液流變學(xué)檢測(cè) 第27天大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血4 ml，肝素抗凝，測(cè)定在不同切變率下的全血黏度。

1.4.3 生物標(biāo)記物及臟器指數(shù) 腹主動(dòng)脈取血4 mL，3000 r/min 4℃離心10 min，取上層血清－80℃保存，放免法檢測(cè)血栓素B2(TXB2)、前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)［8，11］、內(nèi)皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)［9，11］、白介素4 (IL-4)、(干擾素)IFN-γ等指標(biāo);大鼠放血處理后取胸腺及脾臟稱重并計(jì)算臟器指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)×10/體質(zhì)量(g)，脾指數(shù)=脾質(zhì)量(mg) ×10/體質(zhì)量(g)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，定量資料采用Kolmogorov-Smirnova進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、耐疲勞時(shí)間、胸腺和脾臟指數(shù)及免疫因子

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠耐疲勞時(shí)間顯著縮短，體質(zhì)量顯著減輕，胸腺及脾臟指數(shù)均顯著下降(P＜0.05，P＜0.01)，提示2種復(fù)合因素誘導(dǎo)下的模型大鼠均出現(xiàn)氣虛乏力體征，免疫功能也出現(xiàn)缺陷。增加皮下注射腎上腺素這一誘導(dǎo)因素后，雄性動(dòng)物中，模型Ⅳ組耐疲勞時(shí)間和體質(zhì)量顯著降低，胸腺指數(shù)明顯減少，與模型Ⅲ組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);雌性大鼠中，模型Ⅱ組IL-4產(chǎn)生顯著增多(P＜0.01)，提示 Th1/Th2細(xì)胞失衡，免疫功能破壞。正常大鼠中，與雌性正常大鼠比較，雄性正常組胸腺及脾臟指數(shù)明顯偏小(P＜0.01，P＜0.05)，IL-4及IFN-γ水平明顯偏低(P＜0.05)。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、耐疲勞時(shí)間、胸腺和脾臟指數(shù)及免疫因子比較(±s)

表1 各組大鼠體質(zhì)量、耐疲勞時(shí)間、胸腺和脾臟指數(shù)及免疫因子比較(±s)

注:與雌性正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與雄性正常組比較:++P＜0.01;與模型Ⅲ組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

性別 組 別 例數(shù) 游泳時(shí)間 體質(zhì)量 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù) IL4 IFN-γ正 常 組 11 128.18± 9.18 232.36±13.63 22.00±3.11 21. 7.77±0.58 40.45±12.31 62±3.07 8.23±0.57 58.46±10.39雌性 模型Ⅰ組 12 39.92±19.53＊＊ 155.75±12.23＊＊ 6.09±3.01＊＊ 13.31±2.91＊＊ 8.53±0.54 48.49±12.27模型Ⅱ組 10 36.00±20.07＊＊ 158.40±15.30＊＊ 6.56±2.74＊＊ 13.80±3.52＊＊ 8.84±0.54＊＊48.44±17.34正 常 組 10 175.20±14.79* 294.30± 8.56＊＊ 14.08±1.82＊＊ 18.52±1.53* 7.70±0.55* 45.42± 7.82*雄性 模型Ⅲ組 9 83.44±32.88++ 222.22±23.00++ 4.82±2.15++ 12.96±2.99++8.20±0.50 37.65± 7.56模型Ⅳ組 9 49.78±14.18++△△ 204.78±16.84++△△ 2.05±1.34++△ 10.59±2.18++

2.2 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)

表2顯示，與正常組比較，模型組不同切變率下的全血黏度均比空白對(duì)照組升高(P＜0.01)，紅細(xì)胞聚集指數(shù)與卡松黏度與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 血管及內(nèi)皮功能調(diào)控因子

表3顯示，與正常組比較，模型組大鼠TXB2/6-Keto-PGF1α比值均升高(P＜0.01)，提示2種復(fù)合因素誘導(dǎo)下的模型方法均能引起 TXB2、6-Keto-PGF1α含量的明顯變化，TXB2/6-Keto-PGF1α平衡失調(diào)，內(nèi)皮功能障礙，其中模型Ⅲ組和模型Ⅳ組6-Keto-PGF1α含量顯著降低(P＜0.05)，模型Ⅰ組及模型Ⅱ組一氧化氮含量明顯下降，模型Ⅲ組一氧化氮含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示大鼠內(nèi)皮舒張功能異常［8］。與雌性正常大鼠比較，雄性大鼠VEGF含量明顯偏低(P＜0.05)。

表2 各組大鼠血流變比較(±s)

表2 各組大鼠血流變比較(±s)

注:與雌性正常組比較:＊＊P＜0.01;與雄性正常組比較:++P＜0.01

性別 組 別 例數(shù) 1s－1 30 s－1 50 s－1 200 s－1紅細(xì)胞聚集指數(shù) 卡松黏度雌性 正 常 組 11 25.55± 2.33 5.72±0.33 5.09±0.28 4.11±0.206.21±0.33 3.22±0.13模型Ⅰ組 12 69.93±33.88＊＊ 9.46±2.91＊＊ 7.94±2.29＊＊ 5.57±1.33＊＊ 11.31±3.32＊＊ 3.60±0.89模型Ⅱ組 10 85.20±43.62＊＊ 10.50±3.22＊＊ 8.65±2.40＊＊ 5.90±1.26＊＊ 13.54±4.26＊＊ 3.60±0.50雄性 正 常 組 10 34.14± 4.82 6.39±0.45 5.58±0.36 4.31±0.26 7.92±0.98 3.21±0.21模型Ⅲ組 9 125.70±31.54++ 14.14±0.96++ 11.49±0.74++ 7.58±0.84++ 16.10±3.38++ 4.41±0.81++模型Ⅳ組 9 115.79±14.55++ 13.36±1.14++ 10.88±0.91++ 7.21±0.62++ 15.71±1.84++ 4.41±0.47++

表3 各組大鼠血管及內(nèi)皮功能調(diào)控因子比較(±s)

表3 各組大鼠血管及內(nèi)皮功能調(diào)控因子比較(±s)

注:與雌性正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與雄性正常組比較:+P＜0.01，++P＜0.01

性別 組 別 例數(shù)PGF TXB TXB/6K NO ET VEGF雌性 正 常 組 11 111.51±11.81 112.77±23.07 1.02±0.22 44.7 64.07±11.46 0.60±0.18 8±7.56 73.16±14.48 0.68±0.17模型Ⅰ組 12 105.22±13.05 131.60±33.24 1.26±0.31* 36.56±7.75＊＊ 75.25±16.32 0.66±0.17模型Ⅱ組 10 106.95±13.63 135.02±22.89 1.26±0.17* 35.38±1.60＊＊ 74.95±12.73 0.64±0.19雄性 正 常 組 10 117.32±16.30 107.83±26.18 0.93±0.23 41.82±7.08 63.16±10.41 0.49±0.12*模型Ⅲ組 9 102.29±11.18+ 129.71±31.41 1.26±0.24++ 39.27±7.92 74.61±17.94 0.51±0.15模型Ⅳ組 9 103.59±11.03+ 127.84±27.79 1.22±0.18++ 35.65±2.07+

3 討論

以上2種復(fù)合因素造模方法都可成功地形成氣虛血瘀證，大鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕，耐疲勞時(shí)間縮短，細(xì)胞免疫功能顯著降低，血藥流變呈低黏狀態(tài)、血管及內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［12］。腎上腺素作為血小板聚集的強(qiáng)誘導(dǎo)劑［13］，可造成血小板聚集、末梢血管收縮、外周阻力增加，使得該證候成模率更高。本研究將皮下注射腎上腺素及性別作為造模影響因素分別進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在明確這2個(gè)因素對(duì)模型微觀指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示，雄性大鼠中，皮下注射腎上腺素后大鼠的耐疲勞時(shí)間及體質(zhì)量下降更為明顯，胸腺指數(shù)也明顯下降;雌性大鼠中，除血清IL-4水平有顯著差異外，2種造模方法對(duì)微觀指標(biāo)的影響均無(wú)差異，提示雄性大鼠對(duì)腎上腺素更為敏感，在采用限食、強(qiáng)迫游泳、皮下注射腎上腺素綜合因素造模時(shí)，宜雌雄分開或使用單一性別。

已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，大鼠在免疫病變［14］或免疫指標(biāo)［15］方面有性別差異。鄭國(guó)強(qiáng)［16］等也發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠的胸腺質(zhì)量和胸腺指數(shù)均大于雄性小鼠，雌性小鼠脾小體的形態(tài)結(jié)構(gòu)也比雄性小鼠更完整。提示雌雄小鼠之間存著免疫差異，特別是胸腺方面。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，免疫差異也存在于大鼠中。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，除免疫指標(biāo)外，雌性或雄性造模大鼠的體質(zhì)量、耐疲勞時(shí)間、血液流變學(xué)指標(biāo)、TXB2/6-Keto-PGF1α的比值并無(wú)明顯差異，因此在不考慮免疫功能的前提下，氣虛血瘀模型建模時(shí)可以不必考慮性別因素對(duì)模型的影響，藥效學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)也可雌雄兼用。需要考察藥物對(duì)免疫功能的影響時(shí)應(yīng)考慮性別差異，避免數(shù)據(jù)上的假陽(yáng)性或假陰性。

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Effects of Different Compound Factors on the Establishment of Qi Deficiency and Blood Stasis Model

SUN Xiao-Ping1，2，3，ZHOU Jun1，2，3，CHANG Xiu-juan1，2，3△，WANG Zhen-zhong1，2，3，XIAO Wei1，2，3
(1.Jangsu Kanion pharmaceutical Co.，Ltd，Lianyungang 222001，China; 2.State Key Laboratory of Pharmaceutical New-tech for Chinese Medicine，Lianyungang 222001，China; 3.Enterprises Academician Workstations in Jiangsu Province，Lianyungang 222001，China)

Objectives:To research the effect of different composite factors on Qi-deficiency and Blood-stasis model and determine the major points of model.Method:The rat models were induced by diet restriction，forced swimming or adrenalin by subcutaneous injection.One model was induced by diet restriction，forced swimming，another model was induced by diet restriction，forced swimming and adrenalin by subcutaneous injection.The signs and microcosmic index of model rats in different gender groups were observed.Results:Compared with normal group，the body weight was decreased，time of fatigue resistance was increased，immune function was decreased，and endothelial function was imbalanced in each model group.Compared with model group induced by first composite factors，model group added adrenalin by subcutaneous injection were observed less body weight，time of fatigue resistance and thymus index.The male rats were founded longer time of fatigue resistance，less of thymus and spleen index，lower level of IL-4，IFN and VEGF than female rats.Conclusion:Two modeling methods can successfully make Qi-deficiency and Blood-stasis syndrome.The male rats have more sensitive reaction after subcutaneous injecion of adrenalin，therefore we advise that rats model should be male and female apart，or using a single gender.Experiments found in SD male rats immune difference，and the serum VEGF levels have significant differences.

Qi-deficiency and Blood-stasis model;Diet restriction;Forced swimming;Adrenaline;Gender

R-33

:B

:1006-3250(2016)07-0901-03

2015-11-20

現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺(tái)(2013ZX09402203)

孫曉萍(1981-)，女，湖北人，工程師，醫(yī)學(xué)碩士，從事藥物作用機(jī)制與藥物代謝研究。

△通訊作者:蕭 偉(1959-)，男，高級(jí)工程師，醫(yī)學(xué)博士，從事中藥新劑型的研究與開發(fā)，Tel:0518-85521956，E-mail: wzhzh-nj@tom.com。