王　建，遲勝起，韓　磊，張劍峰，梁文星（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植保學(xué)院，山東　青島　266109）

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馬鈴薯紡錘塊莖類病毒內(nèi)蒙古分離株的克隆及序列分析

王建，遲勝起*，韓磊，張劍峰*，梁文星
（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植保學(xué)院，山東青島266109）

摘要：采用內(nèi)蒙古自治區(qū)采集的感染馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potato spindle tuber viroid，PSTVd）的馬鈴薯材料，克隆了PSTVd的全長基因，命名為內(nèi)蒙古分離株（PSTVd-IM），對(duì)其序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明，該序列大小為359 bp，其與俄羅斯的PSTVd分離株（EF044305.1）序列吻合。將該分離物與國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的PSTVd株系進(jìn)行了比較，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定了其分類地位；通過序列比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)PSTVd-IM與已報(bào)道的PSTVd三類致病類型株系：強(qiáng)株系（U23058.1）、中間株系（AY937179.1）和弱株系（M14814.1）的同源性分別為97.78%，98.61% 和99.44%；且與這三種類型株系在中央保守區(qū)、致病區(qū)和可變區(qū)結(jié)構(gòu)域存在差異，說明這些結(jié)構(gòu)域可能與其致病性相關(guān)。PSTVd-IM的序列與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析有利于明確其來源及致病性的差異位點(diǎn)，對(duì)于PSTVd的致病機(jī)制的研究具有重要意義。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯紡錘塊莖類病毒；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；序列分析

馬鈴薯生產(chǎn)中通常采用無性繁殖，容易感染多種病害，其中病毒病是引起馬鈴薯種薯退化和商品減產(chǎn)的主要原因。馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potato spindle tuberviroid，PSTVd）是影響馬鈴薯生產(chǎn)的重要病原之一。PSTVd是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的類病毒[1]，隸屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科（Pospiviroidae）。PSTVd是沒有蛋白質(zhì)外殼包被的裸露的單鏈環(huán)狀RNA分子，僅360 bp左右，不編碼蛋白質(zhì)，但并不意味著沒有生物學(xué)功能，在短短的核酸序列中集中了類病毒的許多生物學(xué)功能。PSTVd擁有環(huán)狀結(jié)構(gòu)和高度的自我互補(bǔ)性，為了減少自由能，很容易壓縮成棒狀二級(jí)結(jié)構(gòu)[2]，形成5個(gè)功能區(qū)[3,4]：左末端區(qū)（TL，1 ～6/315 ～359）；致病區(qū)（P，47 ～73/ 286 ～314）；中央保守區(qū)（C，74 ～120/240 ～285）；可變區(qū)（V，121 ～148/212 ～239）；右末端區(qū)（TR，149 ～ 179/180 ～211）。共可形成27個(gè)環(huán)（Loop），其中有多個(gè)環(huán)參與系統(tǒng)移動(dòng)（Trafficking，T），多個(gè)環(huán)參與了復(fù)制（Replication，R）[5]。PSTVd的左末端區(qū)、右末端區(qū)[4]和中央?yún)^(qū)[6]參與了癥狀的表達(dá)。致病區(qū)外E環(huán)結(jié)構(gòu)域（Loop Emotif）是中央保守區(qū)的一部分，其中含有進(jìn)化上保守的序列GAAA，在PSTVd復(fù)制過程中，對(duì)類病毒分子的最終環(huán)化起作用[7]。在所有類病毒中，致病區(qū)少數(shù)幾個(gè)核苷酸（約1%核苷酸）的變化即可改變病害癥狀的嚴(yán)重程度。

PSTVd具有高度的侵染性，極易通過接觸農(nóng)具、衣物和切刀等進(jìn)行汁液傳播，也能通過水進(jìn)行傳播[8]，也可通過花粉和子房傳到種子中，也可介體昆蟲、塊莖傳播。PSTVd可在馬鈴薯的任何生育時(shí)期進(jìn)行侵染，并表現(xiàn)多種癥狀，潛伏期長，給馬鈴薯生產(chǎn)帶來了巨大的威脅。馬鈴薯在受到PSTVd侵染時(shí)，通常減產(chǎn)30%左右，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)90%[9]。PSTVd能與其他病毒進(jìn)行互作，如隨馬鈴薯卷葉病毒（Potato leafroll virus，PLRV）粒體在蚜蟲中進(jìn)行傳播[10]；PSTVd與PVY復(fù)合侵染對(duì)PVY有增殖作用[11]，復(fù)合感染常造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。PSTVd的致病性具有強(qiáng)株系、弱株系和中間株系。PSTVd強(qiáng)株系可引起減產(chǎn)60% ～70%，弱株系減產(chǎn)20% ～35%[12]。PSTVd的寄主范圍很廣，可侵染31 科90多種植物，如龍葵、洋酸漿、黃花煙、心葉煙、德伯尼煙、假酸漿、莨菪以及茄子。馬鈴薯很多品種都易被感染，表現(xiàn)出不同程度的形態(tài)變化和產(chǎn)量損失[13]。馬鈴薯紡錘塊莖類病毒很難通過莖尖剝離技術(shù)汰除，目前還沒有脫掉該類病毒的有效措施[14]。

本研究通過2步RT-PCR方法，對(duì)來自內(nèi)蒙古自治區(qū)具有PSTVd癥狀的馬鈴薯植株進(jìn)行擴(kuò)增，得到了PSTVd的cDNA克?。≒STVd-IM），對(duì)PSTVd-IM內(nèi)蒙株系的基因結(jié)構(gòu)的分析，初步確定其來源及其特點(diǎn)，開展該類病毒基因相關(guān)結(jié)構(gòu)及致病性分析，為今后PSTVd的深入研究和防治奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1感病材料

感病馬鈴薯2013年采自內(nèi)蒙古自治區(qū)商都田間。

1.1.2試驗(yàn)試劑

反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購于Genview，RNAiso Plus試劑盒、Agrose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0購于鼎國公司，克隆載體pMD-19T，DNA回收試劑盒，rTaq，dNTPs，質(zhì)粒小提取試劑盒（Fast Plasmid Minikit）均購自TaKaRa公司。

1.1.3菌種

大腸桿菌Escherichia coli JM109感受態(tài)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4引物設(shè)計(jì)

PSTVd基因特異性引物：正向引物1F：5'-ATCCCCGGGGAAACCTGGAGCGAAC-3'，反向引物2C：5'-CCCTGAAGCGCTCCTCCGAG-3'。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1馬鈴薯葉片總RNA的提取

染病馬鈴薯發(fā)芽后，稱取新鮮馬鈴薯葉片按TaKaRa RNAiso Plus試劑盒操作手冊進(jìn)行操作，最后溶于RNase-free的滅菌DEPC水中，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

1.2.2 cDNA的合成及PCR擴(kuò)增

以感病植株總RNA為模板，2C為反轉(zhuǎn)錄引物，合成cDNA的第一鏈，體系為總RNA 5μL，20μmol/L下游引物2μL，RNase Free H2O 4μL，88℃變性10m in，冰上冷卻3min，37℃保溫20 min。然后加入M-MLV（RNaseH-）（50 U/ μL）0.25μL，RNase Inhibitor（20 ～40 U/μL）0.5μL，dNTP Mixture（2.5 mmol each）2μL，5×M-MLV Buffer 4μL，后用RNase Free H2O補(bǔ)足20μL。反應(yīng)條件為42℃60min，70℃15min，冰上冷卻即合成cDNA第一條鏈。

以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25μL，上游引物（20μmol/L）0.5μL，下游引物（20μmol/L）0.5μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTPs Mixture（2.5 mmol each）4μL，ddH2O補(bǔ)足50μL。程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min，94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆及序列測定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物和pMD19-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含100μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，挑取單菌斑，篩選陽性克隆，隨機(jī)挑選3個(gè)陽性克隆，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

2　結(jié)果與分析

2.1馬鈴薯總RNA的提取

利用TaKaRa RNAiso Plus試劑盒進(jìn)行馬鈴薯總RNA提取，由圖1可見，在1%瓊脂糖凝膠上馬鈴薯葉片總RNA條帶清晰，28 S大約是18 S的兩倍，RNA幾乎沒有降解，樣品質(zhì)量較好，可用于下一步的RT-PCR。

2.2 PSTVd-IM的克隆

利用PSTVd基因的特異性引物1F和2C，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，得到一條大小約360 bp的特異DNA片段，與預(yù)期設(shè)計(jì)的PSTVd的全長基因片段大小一致（圖2）。經(jīng)測序，PSTVd-IM分離物含有359 bp堿基（圖3），由此已經(jīng)獲得全長的PSTVd-IM克隆。

圖1　馬鈴薯總RNA的提取Figure 1 Extraction of total potato RNA

圖2　PSTVd-IM的RT-PCR克隆Figure 2 Cloning of PSTVd-IM by RT-PCR

圖3　PSTVd-IM基因序列Figure 3 Full-length sequence of PSTVd-IM

2.3 PSTVd全長核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4　依據(jù)PSTVd全長核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree of PSTVd isolates based on full-length nucleotide sequence

將所獲得的PSTVd-IM與NCBI已公布的127個(gè)全長PSTVd分離物核苷酸序列，利用MEGA5.1軟件，采用鄰連法建立了PSTVd不同分離物的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。結(jié)果表明，PSTVd的聚類主要可以分為3大分支，其中國內(nèi)已公布的4個(gè)全長的PSTVd分離物（PSTVd-HB，AY360446.1（北京），PSTVd-IM，PSTVd-DB（黑龍江）），分屬其中2個(gè)大分支，PSTVd-IM與PSTVd-DB（黑龍江）聚在一支，PSTVd-HB和AY360446.1（北京）聚在一支，且2者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明國內(nèi)至少存在2個(gè)差異較大的PSTVd株系；本研究所獲得的PSTVd-IM與源于俄羅斯的PSTVd分離株EF044305.1關(guān)系最近，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩者序列同源性100%；由圖4同時(shí)也可以看出，不同區(qū)域的PSTVd序列呈現(xiàn)多態(tài)性。

2.4 PSTVd-IM與PSTVd強(qiáng)株系、中間株系、弱株系的結(jié)構(gòu)差異

將PSTVd-IM與強(qiáng)株系（U23058.1）、中間株系（AY937179.1）和弱株系（M14814.1）進(jìn)行了系列比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，由圖5可以看出PSTVd-IM與強(qiáng)、中、弱3個(gè)株系的同源性分別為：97.78%， 98.61%和99.44%。用CLCRNAWorkBench 4.0軟件對(duì)四者的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)構(gòu)表明，其中有3個(gè)結(jié)構(gòu)域存在著差異（圖6）。

由圖6可以看出，在致病區(qū)PSTVd-IM和弱株系在310位堿基由A突變?yōu)閁，導(dǎo)致其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而強(qiáng)株系和中間株系沒有發(fā)生變化；在中央保守區(qū)，由于123位核苷酸的缺失，導(dǎo)致PSTVd-IM和弱株系在237 ～246位的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而強(qiáng)株系和中間株系不發(fā)生缺失；PSTVd-IM在255位由堿基C突變?yōu)閁，導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而強(qiáng)株系、中間株系和弱株系均沒有發(fā)生改變，這是否會(huì)給其致病性帶來變化，還有待進(jìn)一步的研究；在可變區(qū)，PSTVd-IM和弱株系120位核苷酸分別由A突變?yōu)镃和U，對(duì)其自身的二級(jí)結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生影響，但這卻導(dǎo)致弱株系和PSTVd-IM的結(jié)構(gòu)域與強(qiáng)株系和中間株系的結(jié)構(gòu)域發(fā)生了變化。

圖5　PSTVd-IM與不同致病性株系的同源性分析Figure 5 Homology analysis of PSTVd-IM w ith different pathogenic PSTVd strains

圖6　PSTVd-IM與不同致病性株系的PSTVd RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析Figure 6 RNA secondary structure analysis of PSTVd-IM and various pathogenic PSTVd strains

3　討　論

PSTVd的分子很小，僅有359 bp，其二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與其致病性相關(guān)，其微小的變化就有可能會(huì)導(dǎo)致變異。何小源等[15]的研究也證實(shí)了PSTVd強(qiáng)毒株系和弱毒株系僅僅相差3個(gè)核苷酸，二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化也與之相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，致病區(qū)外E環(huán)結(jié)構(gòu)域（Loop E motif）的1個(gè)核苷酸的改變就能影響PSTVd的致病性和其寄主選擇性。PSTVd（KF44022分離物）259位核苷酸由C突變?yōu)閁可以擴(kuò)大馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）的寄主范圍，使之可以侵染煙草[16]；PSTVd-Int257位核苷酸由U突變?yōu)镃或A，可使PSTVd-Int在煙草原生質(zhì)中的復(fù)制率提高5 ～10倍，并且由U到A的突變可導(dǎo)致中等致病力的PSTVd-Int轉(zhuǎn)變?yōu)橹滤乐晗礫17]。通過PSTVd-IM與不同致病性菌株的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異的比較，發(fā)現(xiàn)其與弱株系的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，但其致病力終究如何還有待于進(jìn)一步的驗(yàn)證，這些結(jié)構(gòu)域的突變分析將有助于PSTVd致病性機(jī)制的深入研究。

由PSTVd全長序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的PSTVd菌株大致可以分為3個(gè)大的分支，中國已經(jīng)擁有其中的2個(gè)分支。同時(shí)，從PSTVd的系統(tǒng)發(fā)育樹也能看出，中國現(xiàn)存的內(nèi)蒙株系和東北株系均與俄羅斯的PSTVd株系親緣關(guān)系密切，河北和北京株系則與歐洲的PSTVd株系關(guān)系密切，PSTVd近幾年在北方發(fā)生呈上升趨勢，加強(qiáng)PSTVd的檢測，有利于阻止PSTVd的傳播和防治，建立完善的PSTVd的檢測體系，是現(xiàn)階段防止PSTVd擴(kuò)散的有效措施。

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Cloning and Sequence Analysis of Potato Spindle Tuber Viroid Isolate from Inner Mongolia

WANG Jian, CHI Shengqi*, HAN Lei, ZHANG Jianfeng*, LIANG Wenxing
(College ofAgronom y and PlantProtection,Qingdao Agricu lturalUniversity,Qingdao,Shandong 266109,China)

Abstract:ract:The whole gene ofpotato spindle tuberviroid(Potato spindle tuber viroid,PSTVd),named PSTVd-IM,which was isolated from the diseased potato from InnerMongolia,was cloned and sequenced in this research.The results showed that ithad 359 bp and its sequence was the same as the isolate EF044305.1 from Russia.The phylogenetic tree of PSTVd isolate was built and analyzed based on the full-length nucleotide sequence of isolates from NCBIby MEGA5.1,which showed relativeness of PSTVd-IM w ith the isolates published.At the same time,homology analysis and second structure analysis ofPSTVd-IM w ith differentpathogenic PSTVd strains(severe strain U23058.1,intermediate strain AY937179.1 and weak strain M 14814.1)were done to show the difference among them.This researchwould lay the foundation forstudying the pathogenicmechanism.

KeyWords:ords:potato spind le tuber viroid;RT-PCR;sequence analysis

*通信作者（

Corresponding author）：遲勝起，副教授，主要從事馬鈴薯病毒病害研究，E-mail:chishq@163.com；張劍峰，教授，主要從事馬鈴薯病毒病害研究，E-mail:qauzjf@163.com。

作者簡介：王建（1989-），女，碩士研究生，主要從事馬鈴薯病毒研究。

基金項(xiàng)目：山東現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系薯類創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SDAIT-10-011-06）；山東省‘泰山學(xué)者’建設(shè)工程資助。

收稿日期：2015-06-05

中圖分類號(hào)：S532

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672－3635（2016）01-0031-08