徐園園,魏迎鳳,盧學超,解其華,翟林云 (南通市第三人民醫(yī)院,江蘇南通226000)
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活性維生素D3灌胃治療大鼠糖尿病腎病的效果及其作用機制
徐園園,魏迎鳳,盧學超,解其華,翟林云 (南通市第三人民醫(yī)院,江蘇南通226000)
摘要:目的觀察活性維生素D3灌胃治療大鼠糖尿病腎病的效果,并探討其機制。方法 雄性SD大鼠40只,隨機分為對照組、模型組、實驗1組、實驗2組及實驗3組各8只。模型組、實驗1組、實驗2組及實驗3組采用鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病腎病大鼠模型,對照組注射同體積的枸櫞酸鉀緩沖液。實驗1、2、3組分別以0.03、0.06、0.12 μg/(kg·d)骨化三醇(活性維生素D3)灌胃,1次/d,模型組與對照組以等量花生油灌胃。各組均連續(xù)用藥8周。灌胃結束后測定24 h尿蛋白(24 h UTP)、空腹血糖(FBG)、血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血鈣、血磷、25-(OH)D3及甲狀旁腺激素(PTH)。留取標本后處死各組大鼠,取腎臟組織,HE染色,光鏡下觀察腎臟病理學改變;采用免疫組化法檢測各組大鼠腎臟組織中的轉化生長因子β1(TGF-β1)、結締組織生長因子(CTGF)蛋白。結果實驗1、2、3組及模型組的FBG、24 h UTP、BUN、Scr均高于對照組(P均<0.05);實驗1、2、3組的24 h UTP、BUN、Scr低于模型組,其中實驗3組24 h UTP低于實驗1組(P均<0.05)。實驗1、2、3組腎臟病理改變較模型組減輕,以實驗3組最為明顯。模型組腎臟組織中TGF-β1、CTGF表達高于對照組(P均<0.05);實驗1、2、3組TGF-β1、CTGF表達低于模型組,其中實驗3組TGF-β1、CTGF表達低于實驗1組(P均<0.05)。與實驗1組相比,實驗3組PTH水平下降,血鈣、血磷水平升高(P均<0.05)。結論 活性維生素D3灌胃可減輕糖尿病腎病大鼠腎組織病理改變,改善腎功能,其機制可能與下調(diào)TGF-β1、CTGF表達有關;但活性維生素D3以0.12 μg/(kg·d)劑量使用將影響骨質(zhì)代謝。
關鍵詞:糖尿病并發(fā)癥;糖尿病腎??;活性維生素D3;轉化生長因子β1;結締組織生長因子;動物實驗
糖尿病腎病是導致糖尿病患者終末期腎衰竭的重要原因。目前認為轉化生長因子β1(TGF-β1)和結締組織生長因子(CTGF)是糖尿病患者腎小球硬化形成過程中的重要生長因子[1]。近年來,活性維生素D3的腎臟保護作用備受關注。2014年8~12月,本研究觀察了活性維生素D3對大鼠糖尿病腎病的治療作用,并探討其機制?,F(xiàn)報告如下。
1材料與方法
1.1實驗動物及試劑健康雄性SD大鼠40只,清潔級,體質(zhì)量(260±20)g,由南通大學實驗動物中心提供。骨化三醇膠丸(活性維生素D3)購自上海羅氏制藥有限公司;鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司,用前溶解于0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液中,pH 4.5;兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體購自美國Abcam公司;兔抗大鼠CTGF多克隆抗體購自美國Abcam 公司;即用型SABC-POD(兔IgG)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。
1.2動物模型制作及活性維生素D3用法大鼠適應性喂養(yǎng)1周后,隨機分為對照組、模型組、實驗1組、實驗2組及實驗3組各8只。模型組、實驗1組、實驗2組及實驗3組大鼠禁食12 h后以60 mg/kg的STZ于左下腹腔一次性注射制造糖尿病腎病模型,以建模72 h后血糖濃度≥16.7 mmol/L、尿量多于原尿量150%、24 h尿蛋白排泄率>30 mg判定為造模成功。對照組注射同體積的枸櫞酸鉀緩沖液[2]。實驗1、2、3組將骨化三醇溶于0.05 mL花生油,分別以0.03、0.06、0.12 μg/(kg·d)灌胃,模型組與對照組以等量花生油灌胃。各組均連續(xù)用藥8周。于實驗第8周末收集大鼠尿液,采血,解剖腎臟去除包膜,留取腎臟組織。
1.3大鼠腎功能相關指標檢測于實驗第8周末留取標本后處死大鼠。處死前1 d,將大鼠放入洗凈的代謝籠內(nèi),禁食不禁水,收集24 h尿液,用雙縮脲法測定24 h UTP。采用全自動多功能生化分析儀進行測定FBG、血清BUN、Scr、血鈣、血磷。采用羅氏電化學發(fā)光法檢測血清25羥維生素D3[25-(OH)D3]。采用化學發(fā)光微粒子免疫分析法檢測血清PTH。
1.4大鼠腎臟組織病理觀察留取各組大鼠腎組織,置于4%中性甲醛固定,石蠟包埋,切片,行HE染色,光鏡下觀察腎組織病理改變。
1.5大鼠腎臟組織中TGF-β1、CTGF檢測采用免疫組化法檢測大鼠腎臟組織中TGF-β1、CTGF。以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為TGF-β1、CTGF表達陽性,光鏡下(400×)每張切片隨機選取10個區(qū)域,采用Mias-2000圖像分析系統(tǒng)測定陽性細胞的積分光密度,以此代表TGF-β1、CTGF相對表達量。
2結果
2.1各組大鼠腎功能相關指標比較實驗1、2、3組及模型組的FBG、24 h UTP、BUN、Scr均高于對照組(P均<0.05);實驗1、2、3組的24 h UTP、BUN、Scr低于模型組(P均<0.05),其中實驗3組24 h UTP低于實驗1組(P<0.05)。詳見表1。
表1 各組大鼠腎功能相關指標比較±s)
注:與對照組相比,#P<0.05;與模型組相比,*P<0.05;與實驗1組相比,△P<0.05。
2.2各組大鼠腎臟病理改變對照組腎小球體積正常,系膜細胞及基質(zhì)正常,無炎癥細胞浸潤;模型組腎小球體積增大,腎小球系膜基質(zhì)增寬,部分腎小球硬化,并有炎癥細胞浸潤;實驗1、2、3組腎小球體積減小,系膜增生改善,炎癥細胞減少,以實驗3組最為明顯。
2.3各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、CTGF表達比較模型組腎臟組織中TGF-β1、CTGF表達高于對照組(P均<0.05);實驗1、2、3組的TGF-β1、CTGF表達低于模型組(P均<0.05),其中實驗3組TGF-β1、CTGF表達低于實驗1組(P均<0.05)。詳見表2。
2.4各組大鼠骨質(zhì)代謝指標比較與對照組比較,模型組25-(OH)D3下降、PTH升高(P均<0.05);與模型組比較,實驗1、2、3組25-(OH)D3升高、PTH下降,實驗2組血磷水平升高,實驗3組血鈣、血磷水平升高(P均<0.05);實驗2、3組25-(OH)D3、血磷水平高于實驗1組(P均<0.05);實驗3組PTH低于實驗1組、血鈣水平高于實驗1組(P<0.05)。詳見表3。
表2 各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、CTGF表達比較
注:與對照組相比,#P<0.05;與模型組相比,*P<0.05;與實驗1組相比,△P<0.05。
表3 各組大鼠25-(OH)D3、PTH、血鈣、血磷水平比較±s)
注:與對照組相比,#P<0.05;與模型組相比,*P<0.05;與實驗1組相比,△P<0.05。
3討論
糖尿病腎病發(fā)病機制復雜,目前尚未闡明。糖尿病腎病的共同病理變化為細胞外基質(zhì)(ECM)進行性積聚,細胞因子在此過程中起關鍵作用。在糖尿病腎病患者中,高血糖、蛋白糖基化、腎小球內(nèi)壓升高等因素均能刺激TGF-β1、CTGF等多種細胞因子過度表達,引起ECM合成及降解失衡,促使ECM在腎臟過度積聚,并最終導致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。
TGF-β1是目前研究最多、最重要的促纖維化因子之一,其在糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。有報道,糖尿病腎病大鼠腎臟組織中TGF-β1mRNA、蛋白表達均顯著增高,且與腎臟損害的嚴重程度相關[3,4]。TGF-β1參與了腎小球硬化發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)[5~8]。TGF-β1可通過smad3信號轉導通路使腎小球系膜細胞合成過多纖維連接蛋白,加重腎小球硬化[5];TGF-β1可下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)表達,增強MMP特異性抑制物合成,從而促進系膜細胞合成及ECM分泌,導致基底膜增厚、系膜細胞增殖,引起腎小球硬化[6,7]。CTGF在維持細胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用[9]。CTGF可被TGF-β1誘導并激活,并可作為TGF-β1的下游介質(zhì),與TGF-β1共同參與腎小球肥大、系膜細胞增殖、ECM積聚等過程。Yamanaka等[10]在體外實驗中抑制人結膜成纖維細胞內(nèi)源性CTGF表達,發(fā)現(xiàn)即使在培養(yǎng)液中加入TGF-β1,Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白等ECM成分表達也顯著減少,說明CTGF表達受TGF-β1調(diào)節(jié),同時也可調(diào)節(jié)TGF-β1活性。CTGF生物學效應較為單一,阻斷CTGF表達或抑制其生物活性有望成為治療腎臟纖維化的新手段。
活性維生素D3是一種脂溶性維生素,有調(diào)節(jié)鈣磷代謝及骨質(zhì)形成的作用。近期研究[11]證實,活性維生素D3還具有抗炎、抑制腎素血管緊張素系統(tǒng)、減少尿蛋白、調(diào)節(jié)免疫等作用。糖尿病腎病患者普遍存在活性維生素D3缺乏。研究[12,13]表明,應用活性維生素D3治療糖尿病腎病大鼠可改善腎小球濾過屏障功能,減輕炎癥反應,減輕足細胞損傷,減少蛋白尿,并可下調(diào)TGF-β1水平,從而起到延緩腎小球硬化的作用。楊燁等[14]發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達水平越高,糖尿病腎病大鼠腎臟病理改變越嚴重,且活性維生素D3可通過下調(diào)TGF-β1表達而保護腎臟。目前尚無活性維生素D3治療糖尿病腎病的相關標準,對于適宜藥物劑量及該藥對骨質(zhì)代謝的影響仍未明確。
本研究制備了大鼠糖尿病腎病模型,并給予活性維生素D3干預,結果顯示,實驗1、2、3組的24 h UTP、BUN、Scr低于模型組,其中實驗3組24 h UTP低于實驗1組;實驗1、2、3組腎臟病理改變較模型組減輕,以實驗3組最為明顯;實驗1、2、3組的TGF-β1、CTGF表達低于模型組。上述結果再次證實TGF-β1、CTGF參與了糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展[15],而給予活性維生素D3治療可減輕腎臟組織病理改變,改善腎功能,這些治療作用可能與下調(diào)TGF-β1、CTGF表達有關。值得注意的是,實驗3組PTH水平下降,血鈣、血磷水平升高,提示活性維生素D3劑量過大[0.12 μg/(kg·d)]可影響骨質(zhì)代謝,故治療劑量還應謹慎選擇。對于臨床如何使用活性維生素D3治療糖尿病腎病仍需大量的循證醫(yī)學證據(jù),有待進一步研究。
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(收稿日期:2015-10-27)
中圖分類號:R587.1
文獻標志碼:A
文章編號:1002-266X(2016)03-0031-03
doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.011
基金項目:南通市衛(wèi)生局青年科研基金資助項目(WQ2014029)。