魏麗夏，任青，王金慎，趙麗麗，張勇軍(聊城市人民醫(yī)院，山東聊城 252000)

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高壓氧與神經(jīng)生長(zhǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HIBD新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能的影響

魏麗夏，任青，王金慎，趙麗麗，張勇軍(聊城市人民醫(yī)院，山東聊城 252000)

摘要：目的觀察高壓氧(HBO)與神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)缺氧缺血性腦損傷(HIBD)新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能的影響。方法 40只SD大鼠隨機(jī)分為5組各8只，A、B、C、D組大鼠均制備HIBD模型，制模后A組采用HBO聯(lián)合NGF治療，B組采用HBO治療，C組采用NGF治療，D組不干預(yù)；E組大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈只分離而不結(jié)扎，術(shù)后不給予缺氧，不干預(yù)治療。各組大鼠生后30 d進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，比較兩組連續(xù)5 d逃避潛伏期及穿環(huán)指數(shù)；生后42 d進(jìn)行感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能測(cè)試，比較兩組足錯(cuò)誤次數(shù)左右差值、肢體放置左右差值。結(jié)果與E組比較，A組和C組第1、3、4、5天逃避潛伏期長(zhǎng)，B組第1、5天逃避潛伏期長(zhǎng)，D組第1～5天逃避潛伏期長(zhǎng)；與D組比較，A、B、C、E組穿環(huán)次數(shù)多；與E組比較，A、B、C、D組肢體放置左右差值大；與D組比較，A、B、C、E組足錯(cuò)誤次數(shù)左右差值小，肢體放置左右差值?。籔均<0.05。結(jié)論 HBO與NGF聯(lián)合應(yīng)用可改善HIBD新生大鼠學(xué)習(xí)記憶力和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能。

關(guān)鍵詞：高壓氧；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；缺氧缺血性腦損傷；學(xué)習(xí)記憶能力；感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能

新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBD)遠(yuǎn)期可引起智力障礙、癲癇、運(yùn)動(dòng)缺陷和認(rèn)知、學(xué)習(xí)障礙，而新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是指由于圍生期缺氧窒息所導(dǎo)致的HIB，是新生兒期死亡和致殘的主要原因。高壓氧(HBO)療法是指機(jī)體處于高氣壓環(huán)境中，呼吸與環(huán)境等壓的高壓純氧或高壓混合氧，從而達(dá)到治療疾病的目的。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，不僅對(duì)正常神經(jīng)細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用，還能促進(jìn)損傷神經(jīng)元再生和功能恢復(fù)，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)。本研究觀察了HBO與NGF聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HIBD新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能的影響，旨在為兩者的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要儀器及試劑健康7日齡SD大鼠40只，體質(zhì)量(14.5±3.2)g，雌雄不限。RSS-5100便攜式數(shù)字測(cè)氧儀(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司)，YLC0.5/1A嬰兒高壓氧艙(中國(guó)船舶工業(yè)總公司第701研究所)，Morris水迷宮(MT-200，成都泰盟科技有限公司)，Recombinant Rat β-NGF(R&D公司)，氮氧混合氣(貴陽(yáng)申建氣體有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、HIBD模型制備及HBO、NGF干預(yù)40只SD大鼠隨機(jī)分為5組各8只。A、B、C、D組大鼠均制備HIBD模型[1]，即首先將大鼠以仰臥位固定于手術(shù)板上，頸部常規(guī)消毒，正中切口，長(zhǎng)約0.3 cm，血管鉗輕柔分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，用0號(hào)無(wú)菌線雙線結(jié)扎，無(wú)菌手術(shù)刀剪斷下中，然后用無(wú)菌一次性縫線縫合切口。缺血術(shù)后將大鼠置于8%低氧環(huán)境(自制的新生大鼠缺氧裝置)，將8%O2+92%N2以1～2 L/min的速度輸入缺氧裝置，2 h后大鼠從缺氧裝置中取出，缺血缺氧后返回母鼠身邊繼續(xù)哺乳喂養(yǎng)。A組大鼠腦缺氧缺血術(shù)后30 min內(nèi)先腹腔注射0.5 μg的NGF，連續(xù)3 d；后采用HBO治療，1次/d，共7 d。B組大鼠腦缺氧缺血術(shù)后15～30 min采用HBO治療，1次/d，共7 d。C組大鼠腦缺氧缺血術(shù)后30 min內(nèi)腹腔注射0.5 μg的NGF，連續(xù)3 d。D組腦缺氧缺血后，正常飼養(yǎng)，不干預(yù)。E組大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈只分離而不結(jié)扎，術(shù)后不給予缺氧，不干預(yù)治療。

1.3大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試各組大鼠于出生后第30天進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)。①定位航行實(shí)驗(yàn)：主要通過(guò)測(cè)試逃避潛伏期(大鼠尋找并爬上平臺(tái)的路線圖和所需時(shí)間)來(lái)判斷大鼠水迷宮學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1 d先將大鼠放入水池中(不放平臺(tái))自由游泳2 min，使其熟悉迷宮環(huán)境。正式實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5 d，每天分上午和下午兩個(gè)時(shí)間段，每段時(shí)間訓(xùn)練4次，分別從4個(gè)不同的入水點(diǎn)入水。實(shí)驗(yàn)記錄其大鼠逃避潛伏期，如果實(shí)驗(yàn)大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則需將其拿上平臺(tái)，記錄逃避潛伏期為120 s，每次訓(xùn)練時(shí)間間隔60 s。②空間搜索實(shí)驗(yàn)：用于檢測(cè)大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后，對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的保持能力。第6天撤除原平臺(tái)，將大鼠任選1個(gè)入水點(diǎn)放入水中，所有大鼠必須為同一入水點(diǎn)，記錄大鼠在2 min內(nèi)跨越原平臺(tái)的次數(shù)，稱為穿環(huán)指數(shù)。

1.4大鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能測(cè)試各組大鼠于出生后第42天進(jìn)行感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能測(cè)試，包括足錯(cuò)誤實(shí)驗(yàn)和肢體放置實(shí)驗(yàn)。①足錯(cuò)誤實(shí)驗(yàn)：將大鼠放在水平的金屬網(wǎng)格上(50 cm×40 cm，每格3 cm×3 cm，金屬絲直徑0.4 cm)，記錄2 min內(nèi)大鼠前、后爪掉下來(lái)的次數(shù)。因不同大鼠活動(dòng)度有個(gè)體差異，只記錄左右側(cè)錯(cuò)誤次數(shù)的差值。②肢體放置實(shí)驗(yàn)：記錄大鼠在不同的感覺(jué)刺激下左右側(cè)前后爪的放置情況，計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：爪子放置正確、迅速計(jì)0分，遲緩或不完全正確計(jì)1分，未放置計(jì)2分，記錄每只大鼠兩側(cè)得分的差值。

2結(jié)果

2.1各組逃避潛伏期、穿環(huán)指數(shù)比較連續(xù)5 d逃避潛伏期、穿環(huán)指數(shù)比較見(jiàn)表1。

表1　各組連續(xù)5 d逃避潛伏期、穿環(huán)指數(shù)比較±s)

注：與E組比較，*P<0.05，△P<0.01；與D組比較，﹟P<0.01。2.2各組足錯(cuò)誤次數(shù)左右差值、肢體放置左右差值比較足錯(cuò)誤次數(shù)左右差值、肢體放置左右差值比較見(jiàn)表2。

3討論

新生兒HIBD是由于圍產(chǎn)期窒息而導(dǎo)致的缺氧缺血性腦損害，目前治療以對(duì)癥支持治療為主，但迄今仍無(wú)有效治療措施來(lái)減輕HIBD后遺癥[2]。中重度HIBD患兒有很高的病死率，存活者可能遺留嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如腦癱、認(rèn)知障礙、學(xué)習(xí)障礙、癲癇等[3～6]。

表2　各組足錯(cuò)誤次數(shù)左右差值、肢體放置左右差值比較

注：與E組比較，*P<0.05，△P<0.01；與D組比較，﹟P<0.01。

HBO療法是指機(jī)體處于高氣壓環(huán)境中，呼吸與環(huán)境等壓的高壓純氧或高壓混合氧，從而達(dá)到治療疾病的目的。研究[7,8]認(rèn)為，HBO對(duì)HIBD腦組織有保護(hù)。然而，HBO在腦損傷中的應(yīng)用及應(yīng)用效果一直存在爭(zhēng)議。有研究[9]證明，新生大鼠HIBD缺氧缺血后6 h內(nèi)進(jìn)行HBO治療為最佳時(shí)間窗，缺氧缺血后12 h進(jìn)行HBO治療反而會(huì)加重病情[10]。劉麗旭等[11]利用新生大鼠制備HIBD模型，發(fā)現(xiàn)選擇2ATA壓力、穩(wěn)壓時(shí)間為30～60 min的HBO治療大鼠腦損傷效果最佳，過(guò)高的HBO壓力反而加重腦組織損傷。

NGF是發(fā)現(xiàn)最早的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，是由118個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。NGF不僅對(duì)正常神經(jīng)細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用，還能促進(jìn)損傷神經(jīng)元再生和功能恢復(fù)，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)[12]，保護(hù)和修復(fù)缺氧缺血后受損神經(jīng)[13]。在胚胎時(shí)期，NGF分布廣、含量多，為效應(yīng)神經(jīng)元生存所必須。出生后，NGF分布區(qū)域逐漸減少、含量下降。NGF在神經(jīng)損傷后可應(yīng)激性上調(diào)表達(dá)，但這種表達(dá)時(shí)間短、NGF含量較低，不足以全面而持久保護(hù)受損神經(jīng)[14]。因此，外源性NGF的供給是十分必要的。國(guó)內(nèi)外研究證明，在新生動(dòng)物發(fā)生HIBD時(shí)，NGF是可以通過(guò)血腦屏障的，此為外源性NGF治療新生兒HIBD提供了可能理論。

學(xué)習(xí)記憶是大腦最重要的高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)之一，是中樞神經(jīng)功能的整合，學(xué)習(xí)和記憶是兩個(gè)不同又相關(guān)聯(lián)的神經(jīng)生物過(guò)程。水迷宮行為測(cè)定實(shí)驗(yàn)是判定動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶的傳統(tǒng)經(jīng)典方法。30日齡大鼠的腦發(fā)育水平與人類(lèi)幼兒期腦發(fā)育水平相當(dāng)，是智能發(fā)育的關(guān)鍵期，故選用此時(shí)間點(diǎn)研究學(xué)習(xí)記憶能力。感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能結(jié)果受個(gè)體差異因素影響，本實(shí)驗(yàn)采用足錯(cuò)誤和肢體放置實(shí)驗(yàn)兩項(xiàng)測(cè)試提高研究的準(zhǔn)確性。本研究顯示，A組和C組第1天、第3天、第4天、第5天逃避潛伏期較E組長(zhǎng)，B組第1天、第5天逃避潛伏期較E組長(zhǎng)，D組第1～5天逃避潛伏期較E組長(zhǎng)；A、B、C、E組穿環(huán)次數(shù)較D組多；A、B、C、D組肢體放置左右差值較E組大；A、B、C、E組足錯(cuò)誤次數(shù)左右差值較D組小，肢體放置左右差值較D組小。提示HBO與NGF聯(lián)合應(yīng)用能夠改善HIBD新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳惠金,周建德,周澤漢,等.新生大鼠腦缺氧缺血損傷模型的制備[J].上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),1999,19(3):159-160.

[2] Pietrini D, Piastra M, Luca E, et al. Neuroprotection and hypothermia in infants and children[J]. Curr Drug Targets, 2012,13(7):925-935.

[3] Gulczyńska E, Gadzinowski J. Therapeutic hypothermia for neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy[J]. Ginekol Pol, 2012,83(3):214-218.

[4] Tagin MA, Woolcott CG, Vincer MJ, et al. Hypothermia for neonatal hypoxic ischemic encephalopathy: an updated systematic review and meta-analysis[J]. Arch Pediatr Adolesc Med, 2012,166(6):558-566.

[5] Sant′Anna G, Laptook AR, Shankaran S, et al. Phenobarbital and temperature profile during hypothermia for hypoxic-ischemic encephalopathy[J]. J Child Neurol, 2012,27(4):451-457.

[6] Martinez-Biarge M, Diez-Sebastian J, Kapellou O, et al. Predicting motor outcome and death in term hypoxic-ischemic encephalopathy[J]. Neurology, 2011,76(24):2055-2061.

[7] Lyu J, Costantini F, Jho EH, et al. Ectopic expression of Axin blocks neuronal differentiation of embryonic carcinoma P19 cells [J]. J Biol Chem, 2003,278(15):13487-13495.

[8] Calvert JW, Yin W, Patel M, et al. Hyperbaric oxygenation prevented brain injury induced by hypoxia-ischemia in a neonatal rat model[J]. Brain Res, 2002,951(1):1-8.

[9] 劉小紅,趙永利,馬巧梅,等.高壓氧干預(yù)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的時(shí)間窗研究[J].中華兒科雜志,2006,44(3):177-181.

[10] Lou M, Eschenfelder CC, Herdegen T, et al. Therapeutic window for use of hyperbaric oxygenation in focal transient ischemia in rats[J]. Stroke, 2004,35(2):578-583.

[11] 劉麗旭,楊于嘉.高壓氧治療新生大鼠缺氧缺血性腦損傷量效及時(shí)效關(guān)系[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志,2001,3(4):355-358.

[12] Tang XQ, Cai J, Nelson KD, et al. Functional repair after dorsal root rhizotomy using nerve conduits and neurotrophic molecules[J]. Eur J Neurosci, 2004,20(5):1211-1218.

[13] Tuszynski MH, U HS, Alksne J, et al. Growth factor gene therapy for Alzheimer disease[J]. Neurosurg Focus, 2002,13(5):e5.

[14] Lobos E, Gebhardt C, Kluge A, et al. Expression of nerve growth factor(NGF) isoforms in the rat uterus during pregnancy: accumulation of precursor proNGF[J]. Endocrinology, 2005,146(4):1922-1929.

(收稿日期:2015-09-07)

中圖分類(lèi)號(hào)：R722.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)03-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.009