熊愛(ài)為，謝靜燕，趙樹(shù)立

[1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院) 婦科，江蘇 南京　210006； 2.南京醫(yī)科

大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院) 中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京　210006]

?

卵巢癌腹水來(lái)源微囊體促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和耐藥

熊愛(ài)為1，謝靜燕1，趙樹(shù)立2

[1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院) 婦科，江蘇 南京210006； 2.南京醫(yī)科

大學(xué)附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院) 中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210006]

[摘要]目的:通過(guò)檢測(cè)卵巢癌患者腹水來(lái)源的微囊體(MVs)體外促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞株增殖及對(duì)順鉑的藥物耐受作用，探討腹水MVs對(duì)卵巢癌發(fā)生發(fā)展及治療的影響。方法:采用超速離心法分離獲得6例惡性卵巢癌腹水中的MVs，在體外觀察MVs對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的影響，并觀察不同MVs濃度下SKOV3細(xì)胞株對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的耐藥效果。結(jié)果:成功從卵巢癌腹水中獲得了MVs，加入MVs組與對(duì)照組相比，能明顯促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的增殖(P<0.05)，且呈一定的濃度依耐性。一定濃度的MVs可以抑制低濃度的順鉑的細(xì)胞毒性(P<0.05)，當(dāng)藥物濃度增大(順鉑 10 μg·ml-1，紫杉醇 10 μg·ml-1)MVs的抑制作用沒(méi)有意義(P>0.05)。結(jié)論:卵巢癌腹水來(lái)源的MVs能明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖，并在卵巢癌細(xì)胞對(duì)低濃度的順鉑藥物耐受中起促進(jìn)作用，為臨床卵巢癌治療過(guò)程中腹水MVs的檢測(cè)提供新的臨床意義。

[關(guān)鍵詞]卵巢癌； 微囊體； 增殖； 化療； 耐藥

微囊泡(microvesicles，MVs)是指細(xì)胞在靜息或活化狀態(tài)下分泌的一種由脂質(zhì)雙分子層膜包裹著蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、miRNA及l(fā)ncRNA等生物活性物質(zhì)的膜性小囊泡，包括直徑在 150~1 000 nm 的微粒(microparticle ) 和 30~150 nm 的外來(lái)體(exosome)[1]。作為一種特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，MVs可以轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)和功能遺傳物質(zhì)(如DNA、RNA等)到其它細(xì)胞，被認(rèn)為是一種細(xì)胞間信號(hào)傳遞的重要分子[2- 3]。近年來(lái)，它的信號(hào)傳遞功能得到了認(rèn)可，被認(rèn)為是除了可溶性信號(hào)分子和膜錨定受體蛋白之外的、存在于血清等多種體液中的第三種信號(hào)傳遞途徑。越來(lái)越多的研究表明，MVs參與了多種病理發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程[4- 5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在正常細(xì)胞中MVs一般是從細(xì)胞質(zhì)膜的特定區(qū)域脫落釋放的，而在腫瘤細(xì)胞中MVs可以從整個(gè)細(xì)胞表面脫落釋放，而且釋放的量也比正常細(xì)胞多。晚期惡性腫瘤腹水來(lái)源的MVs內(nèi)包涵著少量腫瘤特異的信號(hào)蛋白、miRNAs等信號(hào)分子[6]，有研究表明其與惡性腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分級(jí)、預(yù)后明顯相關(guān)[5]，而關(guān)于惡性腫瘤來(lái)源的MVs對(duì)腫瘤細(xì)胞本身細(xì)胞增殖及對(duì)化療藥物保護(hù)作用尚無(wú)研究。

本研究試圖從卵巢癌患者惡性腹水中分離MVs，并通過(guò)在體外培養(yǎng)時(shí)觀察MVs對(duì)卵巢癌細(xì)胞株的促增殖效應(yīng)以及對(duì)順鉑的細(xì)胞毒性抑制作用，進(jìn)一步探討利用卵巢癌患者惡性腹水中MVs的生物學(xué)效應(yīng)。

1材料與方法

1.1材料來(lái)源

1.1.1細(xì)胞系卵巢癌上皮細(xì)胞SKOV3購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑及儀器RPMI DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液(不含EDTA)、胰蛋白酶EDTA消化液、CCK- 8細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒、DNA含量檢測(cè)試劑盒、Annexin V- PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，四季青血清購(gòu)于杭州天杭生物科技有限公司，順鉑來(lái)自于南京市第一醫(yī)院靜脈輸液配置中心，酶標(biāo)儀BIO- RAD購(gòu)于上海賽默科技生物發(fā)展有限公司，流式細(xì)胞儀BDFACS Canto Ⅱ購(gòu)于美國(guó)BD公司，低溫超速離心機(jī)Optima XPN購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞用含10%血清的RPMI DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，2～3 d更換培養(yǎng)基。

1.2.2MVs提取收集原發(fā)性卵巢癌患者腹水100 ml，患者已簽署知情同意書(shū)，腹水收取前未經(jīng)化療或手術(shù)治療，轉(zhuǎn)移腹水至無(wú)菌50 ml離心管，300×g離心10 min去除活細(xì)胞，吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌管，2 000×g離心10 min去除死細(xì)胞，收集上清，低溫超速離心機(jī)10 000×g離心30 min去除細(xì)胞碎片，收集上清，低溫超速離心機(jī)100 000×g離心70 min得到MVs和少量其他蛋白，PBS溶液重懸MVs和混雜蛋白，低溫超速離心機(jī)100 000×g離心70 min，去除上清，得到MVs，PBS重新溶解后分裝于無(wú)菌EP管，每管吸取5 μl用BCA法測(cè)定MVs中的蛋白濃度來(lái)表示MVs的量，定量后放置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3細(xì)胞增殖檢測(cè)SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為90%時(shí)用胰蛋白酶EDTA消化液消化細(xì)胞，加入適當(dāng)培養(yǎng)基，吹勻后細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞最終密度為1×105ml-1，96孔板每孔加入100 μl吹勻后的細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入MVs，使之濃度梯度分別為0、2.5、5、10、15和 20 ng·ml-1，并設(shè)置6復(fù)孔，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)，24 h后每孔加入10 μl新型細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)溶液CCK- 8(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司 KGA317)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度OD值。細(xì)胞增長(zhǎng)率(%)=(OD值MVs-OD值空白)/OD值空白×100%。

1.2.4順鉑細(xì)胞毒性檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3培養(yǎng)至融合度為50%時(shí)分別加入0、5和15 ng·ml-1的MVs孵育48 h，消化收集細(xì)胞分鋪于96孔板(5×104個(gè)·well-1)，細(xì)胞貼壁后加入終濃度為0、0.625、1.25、2.5、5、10 or 20 μg·ml-1含順鉑培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后加入CCK- 8試劑繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)各孔吸光值(A)。計(jì)算每組細(xì)胞順鉑的IC50值。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期卵巢癌細(xì)胞株SKOV3培養(yǎng)至融合度為50%時(shí)，分別加入0、5和15 ng·ml-1的MVs孵育48 h后，每孔分別加入5和10 μg·ml-1順鉑，并設(shè)置MVs對(duì)照組和SKOV3對(duì)照組，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育24 h后用胰蛋白酶消化液(不含EDTA)消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞后用PBS洗滌細(xì)胞1次(2 000 r·min-1，5 min)，300 μl的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，之后加入5 μl Annexin V- FITC混勻后避光、室溫孵育15 min，上機(jī)前5 min再加入5 μl的PI染色，避光放置10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡率。細(xì)胞周期檢測(cè)：取0、5和15 ng·ml-1的MVs預(yù)孵育細(xì)胞，用0和5 μg·ml-1順鉑處理24 h后收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞1次(2 000 r·min-1離心5 min)，收集1×106細(xì)胞，加入70%的冷乙醇500 μl固定，4 ℃過(guò)夜，染色前用PBS洗去固定液，加入100 μl RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μl PI染色混勻，4 ℃避光30 min，上機(jī)檢測(cè)，記錄繼發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光。分別統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞的死亡率(PI+，%)和細(xì)胞周期(G0/G1期、S期和G2/M期)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用軟件SPSS 13.0，各組間差異用χ2檢驗(yàn)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MVs促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖

成功從6例晚期卵巢癌患者的腹水中(腹水內(nèi)癌細(xì)胞陽(yáng)性)通過(guò)低速離心、高速離心和超速離心等方法分離出MVs。MVs可以在一定濃度范圍內(nèi)刺激卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖:在濃度為2.5 ng·ml-1時(shí)沒(méi)有增殖活性(P>0.05)；在濃度≥5 ng·ml-1時(shí)可以促進(jìn)SKOV3細(xì)胞增殖(P<0.05)，并且在5、10、15 ng·ml-1時(shí)增殖活性成濃度依賴性；而當(dāng)MVs濃度為20 ng·ml-1時(shí)增殖活性達(dá)到平臺(tái)期(圖1)。

與0 ng·ml-1比較，aP<0.05

圖1MVs促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖

Fig 1Microvesicles promoted the proliferation of SKOV3

2.2MVs增加順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞的IC50值

CCK8比色法檢測(cè)顯示，對(duì)空白對(duì)照組相比，10 ng·ml-1的MVs預(yù)處理48 h后SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑IC50值明顯升高(P<0.05)，而5 ng·ml-1MVs預(yù)處理組則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。結(jié)果表明，MVs可以提高SKOV3細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。

與0 ng·ml-1比較，aP<0.05

圖2MVs增加順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞的IC50值

Fig 2Microvesicles improved the tolerance of skov3 for cis- platinum

2.3MVs降低順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞的細(xì)胞毒性

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，在低劑量的順鉑(5 μg·ml-1)處理組，MVs可以呈一定劑量依賴性地降低順鉑導(dǎo)致的SKOVE3細(xì)胞的死亡率(PI+，%)(P<0.05)，但當(dāng)順鉑濃度加大到10 μg·ml-1時(shí)MVs對(duì)SKOV3細(xì)胞的耐藥促進(jìn)能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。因此，我們隨后檢測(cè)了在MVs的作用下，5 μg·ml-1順鉑引起的SKOV3細(xì)胞周期的變化情況，結(jié)果表明15 ng·ml-1MVs預(yù)處理組S期細(xì)胞比例明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)，在相同條件下，5 ng·ml-1順鉑處理組各細(xì)胞周期比例則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表1MVs處理下SKOV3細(xì)胞死亡率

Tab 1The mortality of SKOV3 imposed on microvesicles

順鉑濃度不同MVs濃度下SKOV3細(xì)胞死亡率/%0ng·ml-15ng·ml-115ng·ml-15μg·ml-127.3±4.522.3±3.4a20.9±4.3a10μg·ml-151.1±9.148.3±5.747.9±7.2

與0 ng·ml-1MVs處理組比較，aP<0.05

3討論

目前關(guān)于惡性腫瘤細(xì)胞來(lái)源MVs的研究尚少，僅有的研究只表明惡性腫瘤細(xì)胞來(lái)源的MVs與腫瘤細(xì)胞之間的雙向信號(hào)傳遞有關(guān)[3, 7]，并有可能參與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[4, 6,8- 9]。本實(shí)驗(yàn)表明卵巢癌腹水來(lái)源MVs可在體外刺激卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖，迄今為止國(guó)際上尚無(wú)學(xué)者進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，僅有Giusti 等學(xué)者發(fā)現(xiàn)肺小細(xì)胞癌來(lái)源MVs在體外一定濃度下能顯著促進(jìn)小細(xì)胞癌間質(zhì)干細(xì)胞的增殖，但相關(guān)機(jī)制尚無(wú)闡述。關(guān)于本實(shí)驗(yàn)MVs促進(jìn)SKOV3細(xì)胞增殖的機(jī)制存在兩種可能：(1) 卵巢癌腹水來(lái)源MVs中除包含RNA、miRNA、基因組DNA等核酸類物質(zhì)外，還包含生長(zhǎng)因子及生長(zhǎng)因子受體[10]，卵巢癌細(xì)胞膜表面釋放出的MVs在被臨近細(xì)胞胞飲的過(guò)程中囊內(nèi)生長(zhǎng)因子與臨近細(xì)胞膜表面生長(zhǎng)因子受體相結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞增殖；(2) 卵巢癌腹水來(lái)源MVs中包含有mRNA、miRNA、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、抗原提呈物質(zhì)等成分，參與細(xì)胞間信號(hào)傳遞，使細(xì)胞間信號(hào)連接增強(qiáng)，可能通過(guò)細(xì)胞間共刺激作用促進(jìn)細(xì)胞增殖。如加拿大麥吉爾大學(xué)Janusz Rak等研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞間共刺激分子如人類白細(xì)胞抗原1(human leukocyte antigen 1，HLA- 1)、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原等物質(zhì)表達(dá)異?；钴S[10]，可能由此發(fā)揮其促增殖作用。

表25 μg·ml-1順鉑處理后SKOV3細(xì)胞周期%

Tab 2The cell cycle of skov3 imposed on the cis- platinum of 5 μg·ml-1

%

與0 ng·ml-1MVs處理組比較，aP<0.05

關(guān)于MVs促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞耐藥的研究尚無(wú)報(bào)道，但有學(xué)者預(yù)測(cè)其可能參與化療藥物保護(hù)[11]。本實(shí)驗(yàn)表明一定濃度的MVs可顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐受，特別是當(dāng)MVs濃度低于10 μg·ml-1時(shí)MVs對(duì)于SKOV3細(xì)胞的耐藥促進(jìn)能力較為明顯。 Giusti等[10]在電鏡下觀察到惡性腫瘤細(xì)胞膜表面釋放的MVs異?；钴S，惡性腫瘤細(xì)胞可以MVs的形式向外排出胞內(nèi)積聚的細(xì)胞凋亡效應(yīng)因子半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase- 3)，而MVs的釋放被抑制后，半胱天冬氨酸在胞內(nèi)明顯積聚且細(xì)胞凋亡率明顯升高；除了釋放細(xì)胞凋亡抑制因子，有學(xué)者觀察到，在用多柔比星作用于腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)積聚的藥物以及釋放的MVs中包含的藥物濃度明顯升高[12- 14]，且發(fā)現(xiàn)協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃逸的基因表達(dá)也異常升高[15- 16]，但具體機(jī)制尚無(wú)闡述。本實(shí)驗(yàn)對(duì)于細(xì)胞周期的進(jìn)一步分析表明，低劑量的順鉑(5 μg·ml-1)處理下，當(dāng)MVs的處理濃度增加到15 ng·ml-1時(shí)，各個(gè)細(xì)胞周期的變化較為明顯，表現(xiàn)為S期細(xì)胞比例顯著降低，而G0/G1以及G2/M期細(xì)胞比例顯著升高，提示MVs可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來(lái)發(fā)揮其耐藥作用。

卵巢癌腹水來(lái)源的MVs對(duì)腫瘤細(xì)胞促增殖作用及對(duì)順鉑保護(hù)作用的研究開(kāi)創(chuàng)了惡性腫瘤細(xì)胞來(lái)源MVs研究的全新領(lǐng)域，為卵巢癌合并腹水的患者術(shù)中如何妥善處理腹水提供理論基礎(chǔ)，為卵巢癌特別是合并明顯腹水的病人術(shù)后輔助使用化療藥物中如何降低化療藥物耐受提供了全新的研究領(lǐng)域，但MVs促卵巢癌細(xì)胞增殖的作用及耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

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Microvesicles extracted from the ascites can promote SKOV3 cell line proliferation and protect the cell toxicity

XIONG Ai- wei1，XIE Jing- yan1，Zhao Shu- li2

(1.DepartmentofGynaecology，NanjingFirstHospital，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210006，China; 2.DepartmentofCenterLaboratory，NanjingFirstHospital，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210006,China)

[Abstract]Objective: To extract the microvesicles from the ascites of patients with ovarian cancer and explore the proliferation effect on SKOV3 cell lines or toxicity. Methods: The microvesicles from the ascites were got by using the ultracentrifugation. The proliferation effects of SKOV3 cell lines was observed. The cell survival proportion when exposed to cis- platinum in different concentration of microvesicles was paid attention to. Results: We succeeded in acquiring the microvesicles. The SKOV3 cell lines exposed to microvesicles showed significant proliferation effect， which depended on the concentration to some extent. A low concentration of microvesicles could protect the toxicity from the cis- platinum (P<0.05)， but not any significance was observed when the concentration was getting high. Conclusion: The microvesicles from the ascites of patients with ovarian cancer can stimulate the proliferation of SKOV3 cell lines in vitro and help resist the cell toxicity effect of cis- platinum in a low concentration， which sheds lights into the therapy of ovarian cancer especially the patiens with ascites．

[Key words]ovarian cancer; microvesicles; proliferation; chemotherapy; drug resistance

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01.016

[中圖分類號(hào)]R737.31

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671- 6264(2016)01- 0071- 05

[通信作者]謝靜燕E- mail：xiejingyan2001@163.com；趙樹(shù)立E- mail：shulizhao79@gmail.com

[作者簡(jiǎn)介]熊愛(ài)為(1989-)，男，江蘇宿遷人，在讀碩士研究生。E- mail：750704942@qq.com

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81572557)；南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目(201308002, JQX13004)

[收稿日期]2015- 05- 12[修回日期] 2015- 11- 16

[引文格式] 熊愛(ài)為,謝靜燕,趙樹(shù)立.卵巢癌腹水來(lái)源微囊體促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和耐藥[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2016,35(1)：71- 75.

·論著·