朱會杰，曹林，唐波，郭凱

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京　210095； 2.南京諾唯贊生物科技有限公司，江蘇 南京　210000；

3.中國中醫(yī)科學(xué)院 望京醫(yī)院，北京　100102)

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熄風(fēng)湯對帕金森病模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元的影響

朱會杰1，曹林1，唐波2，郭凱3

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京210095； 2.南京諾唯贊生物科技有限公司，江蘇 南京210000；

3.中國中醫(yī)科學(xué)院 望京醫(yī)院，北京100102)

[摘要]目的：觀察10ml·kg-1的給予劑量、限時2周的熄風(fēng)湯灌胃對帕金森病模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元的影響。方法：30只小鼠隨機(jī)分為3組，分別為正常對照組、模型組、熄風(fēng)湯治療組，每組10只。前兩組小鼠進(jìn)行10 ml·kg-1生理鹽水灌胃，熄風(fēng)湯治療組同時間等劑量進(jìn)行熄風(fēng)湯復(fù)方灌胃，連續(xù)2周后模型組和熄風(fēng)湯治療組小鼠腹腔注射30mg·kg-11- 甲基- 4- 苯基- 1，2，3，6- 四氫吡啶(1- methy- 4- phenyl- 1，2，3，6- tetrahy- dropyridine， MPTP)，1次·d-1，連續(xù)7d，對照組予同等體積的生理鹽水注射。3d后進(jìn)行行為學(xué)檢測，免疫印跡和免疫組化檢測酪氨酸羥化酶蛋白水平及其陽性神經(jīng)元數(shù)目。結(jié)果：行為學(xué)檢測結(jié)果顯示，熄風(fēng)湯治療組小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳靜止率較模型組明顯降低(P<0.05),酪氨酸輕化酶蛋白水平及其陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)。結(jié)論：在上述條件下，熄風(fēng)湯有助于改善MPTP致帕金森病模型小鼠的癥狀，對小鼠腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元具有一定的保護(hù)的作用。

[關(guān)鍵詞]熄風(fēng)湯； 1- 甲基- 4- 苯基- 1，2，3，6- 四氫吡啶； 酪氨酸羥化酶； 多巴胺能神經(jīng)元； 帕金森?。?小鼠

帕金森病(Parkinson’s disease， PD)是人類常見的神經(jīng)退行性疾病之一，以靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動障礙為突出癥狀。一項(xiàng)涉及全球20多個國家PD患者流行性病學(xué)的研究數(shù)據(jù)分析表明，我國發(fā)病率為1.9/10萬，歐美國家為9.4/10萬[1]。隨著社會進(jìn)入老齡化階段，PD的發(fā)病率無疑逐步增加。盡管人類認(rèn)識PD已經(jīng)200多年了，但至今PD的發(fā)病機(jī)制仍是謎團(tuán)，研究表明，多個因素參與了PD的發(fā)病機(jī)制，包括環(huán)境因素、線粒體功能障礙與氧化應(yīng)激、自噬、神經(jīng)炎癥反應(yīng)等[2]。PD的發(fā)病基礎(chǔ)為黑質(zhì)致密部(substantia nigra compacta， SNC)內(nèi)的多巴胺能(dopaminergic， DA)神經(jīng)元丟失，殘存神經(jīng)元出現(xiàn)α- 突觸核蛋白(α- synuclein，α- SYN)和路易小體(Lewy Bodys， LBs)，DA釋放減少[3]。α- SYN的調(diào)控作用主要表現(xiàn)在通過作用于酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase， TH)調(diào)節(jié)多巴胺合成[4]。DA神經(jīng)元通過攝取血液中的酪氨酸，經(jīng)胞質(zhì)內(nèi)TH催化形成多巴，多巴由多巴脫氫酶催化生成多巴胺，因此TH的活性和表達(dá)的變化會直接影響多巴胺的生物合成，其數(shù)量的多寡直接反映DA神經(jīng)元凋亡的嚴(yán)重程度。多年來，對PD的治療主要基于藥物治療和外科手術(shù)治療[5]，如左旋多巴胺、抗膽堿藥、單胺氧化酶抑制劑、神經(jīng)保護(hù)劑、腦深部刺激等，但無論哪種藥物都只能減輕臨床癥狀而不能阻止疾病的發(fā)展，長期使用還會出現(xiàn)不良反應(yīng)[6]。

熄風(fēng)湯是一種治療PD療效較為理想的經(jīng)驗(yàn)處方，由柴胡、懷牛膝、白芍、鉤藤、黨參、山藥、知母、桔梗、生甘草組成，臨床觀察到該方劑能夠有效改善PD患者患側(cè)肢體的靜止性震顫、肢體痙攣疼痛、睡眠障礙等癥狀，并延緩或有效逆轉(zhuǎn)PD的疾病進(jìn)程。本研究以1- 甲基- 4- 苯基- 1，2，3，6- 四氫吡啶(1- methy- 4- phenyl- 1，2，3，6- tetrahy- dropyridine， MPTP)構(gòu)建PD模型小鼠為平臺，觀察熄風(fēng)湯治療2周后其行為學(xué)特征、黑質(zhì)DA神經(jīng)元的變化，為進(jìn)一步探討熄風(fēng)湯防治PD打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1動物及試劑

8周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠30只，體重20~25g，購自北京華阜康生物科技有限公司，自由進(jìn)食飲水，室溫20~25℃，濕度45%~65%，光照和黑暗交替各12h的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。試劑：MPTP (Sigma 公司)，TH一抗 (Mlillipore 公司)，BCA蛋白定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)，熄風(fēng)湯復(fù)方(中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院)。

1.2熄風(fēng)湯復(fù)方制備

取一定比例的柴胡、懷牛膝、白芍、鉤藤、黨參、山藥、知母、桔梗、生甘草，水煎煮，得浸膏，浸膏濃縮到60℃時比重為1.10~1.20，存于4℃冰箱備用，使用時采用蒸餾水溶解，混懸至生藥2.0g·ml-1，待灌胃用。

1.3PD模型的制備與分組

實(shí)驗(yàn)動物在動物房安靜環(huán)境下飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、熄風(fēng)湯治療組。前兩組小鼠10 ml·kg-1生理鹽水灌胃，熄風(fēng)湯治療組同時間等劑量熄風(fēng)湯復(fù)方灌胃，連續(xù)2周后，模型組和熄風(fēng)湯治療組小鼠分別腹腔注射MPTP 30mg·kg-1(生理鹽水溶解)，1次·d-1，連續(xù)7d，正常對照組予同等體積的生理鹽水注射，之后進(jìn)行行為學(xué)測定。

1.4行為學(xué)檢測

模型制備完成第3天進(jìn)行行為學(xué)檢測。懸尾實(shí)驗(yàn)：基于Steru等[7]建立的方法，用醫(yī)用膠帶綁住小鼠尾末端部，使其頭部向下懸掛于水平橫桿上，其表現(xiàn)為不動狀態(tài)反映其行為絕望，利用安徽正華公司的懸尾實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)記錄6min內(nèi)2~6min靜止不動時間占總時間的比率，比率越高，絕望程度越強(qiáng)。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)與懸尾類似：將小鼠放入一個直徑25cm、高度40cm、水深20cm、水溫25℃的透明樹脂玻璃水缸內(nèi)，利用安徽正華公司的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)記錄6min內(nèi)2~6min漂浮不動的時間占總時間的比率，比率越高，體能越差，反映其絕望程度越高。

1.5Western Blotting檢測

小鼠進(jìn)行快速斷頭取腦，取小鼠中腦黑質(zhì)部位，勻漿，提取總蛋白，BCA蛋白定量，取一半樣品加入上樣緩沖液水浴煮沸5min備用。取20μg蛋白樣品進(jìn)行12% SDS- PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維素(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉1h，加入小鼠抗 TH 單克隆抗體(1∶1000)(β- Actin為內(nèi)參)，4℃過夜，經(jīng)PBST漂洗后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，ECL顯影液化學(xué)發(fā)光顯色，使用光密度分析軟件進(jìn)行目的條帶檢測及分析。

1.6免疫組化檢測

實(shí)驗(yàn)小鼠用乙醚麻醉后開胸暴露心臟，剪開右心葉放血，從心尖插入灌注針到左心室，生理鹽水灌注直至肝臟發(fā)白、體內(nèi)流出液體為無色，換用4℃ 4%多聚甲醛(paraformaldehyde， PFA)固定至小鼠尾巴彎曲、四肢僵硬，停止灌注。完整取腦，4% PFA后固定1h，15%、20%、30%蔗糖梯度脫水，OCT包埋劑包埋及連續(xù)腦組織冠狀切片，37℃烘箱烘片，5% BSA加0.5% Triton X- 100 0.01mol·L-1PBS封閉，室溫1h，滴加小鼠抗 TH 單克隆抗體(1∶500)，4℃過夜，PBS沖洗，加入熒光二抗(1∶500)，PBS沖洗，DAPI復(fù)染，封片，熒光顯微鏡觀察，每組每只動物取2張黑質(zhì)部腦片，隨機(jī)取6個高倍視野，進(jìn)行黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元計(jì)數(shù)。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)檢測結(jié)果

模型組小鼠于第1 次注射 MPTP 后0.5~1 h 均出現(xiàn)不同程度的震顫、豎毛、翹尾等表現(xiàn)；最后1次注射后，小鼠出現(xiàn)動作減少、倦臥、尾僵直、細(xì)小震顫等癥狀。熄風(fēng)湯治療組小鼠第1次注射 MPTP 后出現(xiàn)輕微的震顫、豎毛表現(xiàn)；最后1次注射后，小鼠尾僵直的頻率、時間較模型組有所改善。懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是將小鼠置于無逃避的應(yīng)激狀態(tài)下，其表現(xiàn)為不動狀態(tài)反映了其行為絕望，可模擬人類的PD癥狀，與正常小鼠相比，模型組懸尾、強(qiáng)迫游泳的靜止率均顯著高于正常對照組(P<0.01)，反映了其激惹程度小于正常組，說明造模成功。熄風(fēng)湯治療組懸尾、強(qiáng)迫游泳靜止率均顯著低于模型組(P<0.05)(表1)，說明熄風(fēng)湯治療在一定程度上改善了PD小鼠的乏力程度。

表1各組行為學(xué)評分比較

Tab 1Behavioral scores in each group

%

與正常對照組相比，aP<0.05， bP<0.01；與模型組相比, cP<0.05

2.2Western blotting檢測結(jié)果

我們利用Western blotting的方法在PD小鼠模型中檢測了TH蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)TH蛋白水平明顯下降，熄風(fēng)湯治療后MPTP 誘發(fā)的TH蛋白表達(dá)水平的下降得到明顯抑制(圖1A)。再對蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測，并對TH蛋白與內(nèi)參蛋白β- Actin的灰度比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，模型組TH蛋白表達(dá)較正常組顯著降低(0.389±0.0356vs0.8096±0.0172，P<0.01)，熄風(fēng)湯治療組TH蛋白水平較模型組顯著上升(0.5511±0.0484vs0.389±0.0356，P<0.05)，說明熄風(fēng)湯對PD小鼠黑質(zhì)TH蛋白具有保護(hù)作用(圖1B)。

A.Western Blotting檢測TH 表達(dá)的變化； B.TH的相對灰度值統(tǒng)計(jì)分析；與正常對照組相比, aP<0.05， bP<0.01;與模型組相比, cP<0.05

圖1不同處理組中小鼠黑質(zhì)TH的表達(dá)變化(n=3)

Fig 1The expression of mice substatia nigra TH in different treatment groups (n=3)

2.3免疫組化檢測結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證熄風(fēng)湯對MPTP 誘導(dǎo)的黑質(zhì)DA神經(jīng)元丟失具有保護(hù)作用，我們應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)方法分別檢測了不同組小鼠黑質(zhì) TH陽性神經(jīng)元的數(shù)目。與正常對照組相比，模型組TH陽性神經(jīng)元呈帶狀分布僅存輪廓，陽性纖維、細(xì)胞稀疏，排列紊亂，胞體面積變小，胞漿染色變淡，突起細(xì)短、稀疏。熄風(fēng)湯治療后，TH陽性神經(jīng)元表達(dá)密集，細(xì)胞濃密，排列整齊。見圖2。

圖2不同處理組小鼠TH神經(jīng)元存活狀態(tài)(n=6,×50)

Fig 2TH neurons suevival status in different treatment groups(n=6,×50)

進(jìn)一步在200倍熒光顯微鏡視野下，神經(jīng)元排列更清楚地呈現(xiàn)在我們面前，與正常對照組小鼠相比，模型組中小鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元顯著減少，熄風(fēng)湯治療組小鼠黑質(zhì)的TH 陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，見圖3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，模型組與正常對照組相比，TH陽性神經(jīng)元數(shù)目顯著下降(66.4±8.5vs33±6.12，P<0.01)，熄風(fēng)湯治療后TH陽性神經(jīng)元數(shù)目增加了近40%(45.6±5.59vs33±6.12，P<0.05)，見圖4。

3討論

PD是一種以中腦黑質(zhì)DA神經(jīng)元變性壞死為特征性病理變化的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理表現(xiàn)為大腦黑質(zhì)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺含量大幅度下降，導(dǎo)致另一神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿相對增加，從而引發(fā)一系列的靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動減少等癥狀[8]。DA神經(jīng)細(xì)胞的變性是 PD 發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，PD 病因、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚不完全明確。到目前為止國內(nèi)外已建立了眾多的動物模型來研究PD，其中應(yīng)用最為廣泛的是MPTP小鼠模型[9]。MPTP具有親脂性，很容易進(jìn)入腦內(nèi)，MPTP穿過血腦屏障后被單胺氧化酶B(monoamine oxidase- B， MAO- B)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的二氫吡啶，隨之氧化為1- 甲基- 4- 苯基吡啶(1- methyl- 4- phenylpyridinium， MPP+)， MPP+通過DA運(yùn)轉(zhuǎn)體進(jìn)入紋狀體DA神經(jīng)元內(nèi)，可抑制TH的活性從而減少多巴胺的合成[9]。正是基于MPTP選擇性作用于SN DA神經(jīng)元并引起多巴胺大幅度減少這一特性，用MPTP制備PD動物模型可模仿人類PD的臨床和病理性特征，從而用于該病的發(fā)病機(jī)制和治療方案的研究[11]。由于MPTP在小鼠體內(nèi)具有級聯(lián)放大作用，故一般在模型制備完成第3天檢測造模是否成功。

PD的典型癥狀就是運(yùn)動機(jī)能受損和大腦多巴胺水平的下降[12]，因此本實(shí)驗(yàn)采用熄風(fēng)湯灌胃干預(yù)MPTP致PD小鼠模型，檢測行為學(xué)及TH含量變化，研究表明，模型組小鼠行為學(xué)明顯減少，TH蛋白及陽性神經(jīng)元顯著降低，證實(shí)了小鼠 PD 模型行為學(xué)變化與TH神經(jīng)元前后形態(tài)學(xué)改變、表達(dá)含量的變化密切相關(guān)，具有一致性[13]。本研究證實(shí)：(1) 行為學(xué)結(jié)果提示熄風(fēng)湯治療組小鼠的行為學(xué)癥狀較模型組有顯著改善；(2) 免疫印跡和免疫組化結(jié)果提示熄風(fēng)湯治療組小鼠黑質(zhì)TH蛋白及陽性神經(jīng)元均較模型組有顯著改善，說明熄風(fēng)湯能保護(hù)由MPTP所誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元的降低。

圖3不同處理組小鼠TH神經(jīng)元存活狀態(tài)(n=6，×200)

Fig 3TH neurons survival status in different treatment groups(n=6，×200)

與正常對照組相比, aP<0.05， bP<0.01; 與模型組相比, cP<0.05

圖4不同處理組TH神經(jīng)元數(shù)目變化(n=6，×200)

Fig 4TH neurons number changes in different treatment groups(n=6,×200)

熄風(fēng)湯的保護(hù)機(jī)制目前還不清楚，可能與下列因素有關(guān)：在熄風(fēng)湯復(fù)方中，柴胡歸肝膽經(jīng)，具有疏肝解郁的作用；懷牛膝引血下行，折其陽亢，并能滋養(yǎng)肝腎；白芍具有柔肝養(yǎng)血和平肝斂陰的作用；鉤藤具有清熱平肝、熄風(fēng)鎮(zhèn)痙的作用?，F(xiàn)代藥理證明白芍、鉤藤均具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜、解痙的作用，黨參、山藥具有補(bǔ)脾益氣的作用，知母具有清虛熱生津作用，能有效改善PD患者陰虛潮熱的癥狀；桔梗宣肺利氣，通調(diào)水道，又能載藥上行；甘草調(diào)和諸藥。全方共奏滋補(bǔ)肝腎、平肝熄風(fēng)之功，有效改善了PD小鼠的癥狀。

盡管熄風(fēng)湯神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的具體機(jī)制尚未闡明，但本研究結(jié)果可以提示：10ml·kg-1的熄風(fēng)湯限時兩周的灌胃，對PD模型小鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元具有保護(hù)作用，為今后深入探討熄風(fēng)湯治療PD提供了新的思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Influence of Xifengtang on the dopaminergic neurons of Parkinson model mice

ZHU Hui- jie1，CAO Lin1，TANG Bo2，GUO Kai3

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China;2.NanjingVazymeBiologicalTechnologyCo.LTD，Nanjing210000，China; 3.WangjingHospitalofChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100102,China)

[Abstract]Objective: To investigate the influence of Xifengtang on the dopaminergic neurons of Parkinson model mice under the conditions of oral administered 10 ml·kg-1body weight dose in two weeks time limit. Methods: 30 mice were randomly assigned into three groups: normal control group， model group and Xifengtang- treated group. The first two groups received 10 ml·kg-1saline and Xifengtang- treated group received the same vomule Xifengtang once a day for 2 weeks. Then the model group and the Xifengtang- treated group were intraperitoneally injected with 30 mg·kg-1MPTP once a day for continuously 7 days， and the same volume saline in normal control group. Three days later， behavioral parameters were recorded and tyrosine hydroxylase level was examined by Western blotting and immunohistochemistry. Results: Xifengtang-treated group showed significantly better performance than the other two groups in the tail suspension and forced swimming tests (P<0.05). Also， the TH levels and the number of TH- positive dopaminergic neurons were significantly higher in Xifengtang- treated group(P<0.05). Conclusions: Under the above conditions， Xifengtang can improve the symptoms of mouse with MPTP- induced Parkinson’s disease. Dopaminergic neurons is also being protected from this degenerative process.

[Key words]Xifengtang; 1- methy- 4- phenyl- 1，2，3，6- tetrahy- dropyridine; tyrosine hydroxylase; dopaminergic neurons； Parkinson’s disease； mice

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01.003

[中圖分類號]R742.5; R285.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)01- 0011- 06

[通信作者]曹林E- mail:caolin@njau.edu.cn

[作者簡介]朱會杰(1988-)，女，河南周口人，在讀碩士研究生。E- mail:zhuhuijie123@163.com

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31101223)

[收稿日期]2015- 07- 20[修回日期] 2015- 09- 12

[引文格式] 朱會杰，曹林，唐波，等.熄風(fēng)湯對帕金森病模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2016，35(1)：11- 16.

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