賀鵬，段莉

[1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳恒生醫(yī)院 口腔科，廣東 深圳　518000； 2.深圳市第二人民醫(yī)院

(深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院)，深圳市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳　518035]

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miRNA- 140過表達(dá)腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

賀鵬1，段莉2

[1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳恒生醫(yī)院 口腔科，廣東 深圳518000； 2.深圳市第二人民醫(yī)院

(深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院)，深圳市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳518035]

[摘要]目的：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)成熟miRNA- 140腺病毒表達(dá)載體。方法：從人類基因組中擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)的miRNA- 140目的基因，將目的基因連接到穿梭質(zhì)粒pDC316- mCMV- EGFP，進(jìn)一步將帶有目的基因的穿梭質(zhì)粒重組到骨架質(zhì)粒AdEasy，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到AAV- 293細(xì)胞中包裝成腺病毒載體，經(jīng)過二次擴(kuò)增之后獲得高滴度的腺病毒，并且檢測(cè)其包裝效率及感染滴度。最后，用目的腺病毒感染骨肉瘤細(xì)胞，通過熒光定量PCR方法檢測(cè)miRNA- 140表達(dá)情況。結(jié)果：酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果均表明，miRNA- 140 成功克隆入pDC316- mCMV- EGFP 載體中。與AdEasy重組后，包裝純化具有感染性的腺病毒miRNA- 140，通過熒光定量PCR檢測(cè)，軟骨肉瘤細(xì)胞中miRNA- 140升高4.2±0.2倍。 結(jié)論：成功構(gòu)建了成熟miRNA- 140的腺病毒表達(dá)載體。

[關(guān)鍵詞]miRNA- 140； AdEasy系統(tǒng)； 熒光定量PCR； 骨肉瘤細(xì)胞

microRNA(微小RNA)以下簡(jiǎn)稱miRNA，是真核生物體內(nèi)廣泛分布的一類長(zhǎng)約19～25 bp核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，其依賴于miRNA成熟體和靶基因mRNA的3′UTR(非翻譯區(qū))互補(bǔ)性的機(jī)制，從而在基因的轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)目的基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)向調(diào)控，導(dǎo)致mRNA翻譯抑制或者降解[1- 2]。miRNA的功能十分強(qiáng)大，人體內(nèi)編碼蛋白質(zhì)的基因中有30%受到miRNA的調(diào)控，而每個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)靶基因，因此，探討miRNA在基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域的研究有重要意義。其中miRNA表達(dá)載體已成為miRNA研究的重要工具之一，miRNA真核表達(dá)載體已被廣泛應(yīng)用于生物體內(nèi)基因的功能研究領(lǐng)域。 目前，在骨肉瘤的治療過程中一般偏向于采用化療聯(lián)合手術(shù)切除的綜合療法。然而，隨著藥物治療時(shí)間的延長(zhǎng)， 骨肉瘤耐藥性出現(xiàn)極大影響了新開發(fā)輔助藥物治療的效果，從而導(dǎo)致骨肉瘤治療失敗。最近研究表明，骨肉瘤的最新生物標(biāo)記miRNA- 140與骨肉瘤的耐藥性關(guān)系密切[3- 5]。因此，構(gòu)建miRNA- 140的過表達(dá)腺病毒載體，可為進(jìn)一步探討miRNA- 140在骨肉瘤耐藥中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究利用基因工程技術(shù)克隆了人miRNA- 140編碼基因， 并完成其腺病毒載體的構(gòu)建。將miRNA- 140與包裝載體轉(zhuǎn)染AAV- 293(腺相關(guān)病毒- 293)細(xì)胞， 收獲腺病毒，為探討miRNA- 140在骨肉瘤耐藥中的作用機(jī)制提供工具。此外，成功構(gòu)建可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)miRNA- 140的表達(dá)載體將為進(jìn)一步研究相關(guān)基因功能奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

AAV- 293細(xì)胞(深圳市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存)，DH5a感受態(tài)細(xì)胞(深圳市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室制備)，pDC316- mCMV- EGFP和 pBHGloxdeltaE1，3Cre質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存)，Trizol試劑 (Invitrogen公司)，DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(Omega公司)，各種工具酶、DNA marker (Takara公司)，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2重組腺病毒載體pDC316- miRNA- 140的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)GenBank中miRNA- 140的序列設(shè)計(jì)合成引物，miRNA- 140編碼序列堿基NW- 926462.1，核苷酸位置 23546875- 23547470(表1)， 以人類基因組為模板，PCR擴(kuò)增出595bp片段。 載體pDC316- mCMV- EGFP經(jīng)PstⅠ 和HindⅢ 酶切后直接去磷酸化，瓊脂糖凝膠電泳后回收線性化載體。常規(guī)方法連接轉(zhuǎn)化，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

表1普通PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量引物序列

Tab 1Primers used for stem- loop reverse transcription or polymerase chain reaction of mi- RNAs

RNA引物序列(5'-3')miRNA-140SenseGTAGGCACTGCAGATGAGAGAGAGAGAGCGCTGTAntisenseATCGACAAGCTTCATGCTGCCTTCAGATGAGAmiRNA-140-5pStem-loopprimerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCATSenseCGCGCCAGTGGTTTTACCCTAntisenseCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAU6Stem-loopprimerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACGATTSenseCCTGCGCAAGGATGACAntisenseGTGCAGGGTCCGAGGT

1.3重組腺病毒miRNA- 140制備

腺病毒包裝細(xì)胞AAV- 293 用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，控制細(xì)胞匯合度為50%進(jìn)行傳代擴(kuò)增。準(zhǔn)備進(jìn)行包裝24h前將細(xì)胞傳代接種于直徑10cm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞生長(zhǎng)密度至培養(yǎng)皿底面積的70%～80%，每皿約3×106個(gè)細(xì)胞。重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316- miR- 140- EGFP、陽性對(duì)照pDC316- GFP，分別通過Biotool DNA Transfection Reagent與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxdeltaE1，3Cre共轉(zhuǎn)染AAV- 293細(xì)胞。每天觀察細(xì)胞出毒現(xiàn)象，出毒現(xiàn)象為細(xì)胞變大變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑。病毒包裝72h后，在激發(fā)波長(zhǎng)488nm處利用倒置熒光顯微鏡觀察AAV- 293細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)，計(jì)數(shù)表達(dá)綠色熒光細(xì)胞的比例，確定轉(zhuǎn)染后病毒包裝感染效率。

1.4病毒液的收集和純化

用細(xì)胞刮刀把貼壁細(xì)胞全部刮落到培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)移到消毒、預(yù)冷的50ml離心管中，反復(fù)凍融4次(-80℃和37℃水浴)， 每次凍融的時(shí)間為15 min左右。隨后以12000 r·min-1離心10 min 除去細(xì)胞碎片。將含病毒的上清轉(zhuǎn)入新的離心管中。向病毒液中加入1/10 體積的氯仿，37 ℃ 300r·min-1劇烈振搖1h。然后加入氯化鈉粉末2.56 g至終濃度為1mol·L-1，4℃、12000 r·min-1離心30min后收集離心管中的上清液于一新的50ml離心管中，加入PEG8000至終濃度10%，振搖至其完全溶解，然后冰上放置1h。最后4 ℃、12000 r·min-1離心30min，棄上清，向沉淀中加入4ml PBS溶解沉淀并分裝凍存于-80℃， 命名為pAd- has- miRNA- 140。

1.5骨肉瘤細(xì)胞中miRNA- 140 表達(dá)水平的檢測(cè)

pAd- has- miRNA- 140感染骨肉瘤細(xì)胞后， 提取總RNA，RT- PCR(實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng))方法檢測(cè)miRNA水平。分別以140- RT和U6- RT為引物，對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，用特異性上游引物140- qRTf 或U6- qRTf 以及通用下游引物Reverse(表1)分別對(duì)目的基因miR- 140 及內(nèi)參基因U6 snRNA 進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量PCR 試劑盒說明進(jìn)行，用ABI 7300熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。采用相對(duì)定量方法進(jìn)行miRNA水平分析，miR- 140表達(dá)水平用2- ΔCt表示，其中ΔCt=CtmiR- 140-CtU6。設(shè)對(duì)照組(感染空載體病毒的骨肉瘤細(xì)胞)miRNA- 140表達(dá)水平為1，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組(干擾pAd- has- miRNA- 140病毒的骨肉瘤細(xì)胞)miRNA- 140的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)圖制作。兩組間miRNA- 140表達(dá)水平比較用Student’t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建、同源重組及鑒定

pDC316- miRNA- 140- EGFP經(jīng)PstⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定(圖1)、DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)，與miRNA- 140編碼序列的同源性為100%。該結(jié)果表明已成功將miRNA- 140定向克隆至穿梭質(zhì)粒pDC316- mCMV- EGFP中。

M.DNA marker；1、2.pDC316- miRNA- 140- EGFP雙酶切

圖1重組腺病毒質(zhì)粒pDC316- miRNA- 140- EGFP的PstⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定

M.DNA marker；1，2.pDC316- miRNA- 140- EGFP double digestion

Fig 1The recombinant adenovirus plasmid was identified withPstⅠ andHindⅢ digestion

2.2pDC316- miRNA- 140質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至腺病毒包裝細(xì)胞AAV- 293

質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV- 293 細(xì)胞24h后倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞變大變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑。72h后熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞熒光表達(dá)率高達(dá)70%(圖2)。該結(jié)果表明pDC316- miRNA- 140質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細(xì)胞AAV- 293。

2.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA- 140的表達(dá)

pDC316- miRNA- 140病毒感染骨肉瘤細(xì)胞后，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA- 140表達(dá)情況，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的miRNA- 140明顯升高(圖3)。該結(jié)果表明pDC316- miRNA- 140病毒已成功感染骨肉瘤細(xì)胞。

3討論

越來越多的研究表明，miRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6- 7]。對(duì)miRNA在不同組織和疾病中的表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)， miRNA 在骨肉瘤表達(dá)譜具有明顯的組織特異性， 在該類疾病中miRNA的表達(dá)譜改變具有明顯的特征。這些特點(diǎn)使miRNA有可能成為骨肉瘤診斷的新的生物學(xué)標(biāo)記和治療藥物作用的靶標(biāo)。大量研究證據(jù)也表明，miRNA異常表達(dá)在骨肉瘤的發(fā)病、后期惡化及轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，許多重要的miRNA參與骨肉瘤細(xì)胞的免疫逃逸反應(yīng)、腫瘤新生血管的生成及其耐藥性等等。目前，腫瘤相關(guān)miRNA具備應(yīng)用于骨腫瘤的分型、診斷、預(yù)后判斷、藥效評(píng)估及用于輔助的相關(guān)治療等方面的潛能[8- 10]。

A.倒置顯微鏡下觀(×100)； B.熒光顯微鏡下觀(×100)

圖2重組腺病毒質(zhì)粒pDC316- miRNA- 140- EGFP在包裝細(xì)胞AAV- 293中的表達(dá)情況

A.Under the invert microscope(×100); B.Under the fluorescent microscope(×100)

Fig 2The expression of the recombinant adenovirus plasmid pDC316- miRNA- 140- EGFP in AAV- 293

圖3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)重組腺病毒pAd- has- miRNA- 140感染骨肉瘤細(xì)胞表達(dá)情況

Fig 3The expression of the recombinant adenovirus pDC316- miRNA- 140 in osteosarcoma cells was detected by real- time PCR

在研究miRNA功能時(shí)， 最簡(jiǎn)潔的方法是利用化學(xué)方法合成的miRNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但化學(xué)合成的這類RNA穩(wěn)定性差、容易發(fā)生降解，不能達(dá)到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)，特別是原代細(xì)胞存在轉(zhuǎn)染效率低等問題。這些不足使得轉(zhuǎn)染miRNA成為研究者需解決的一道難題。利用miRNA構(gòu)建病毒類表達(dá)載體則能夠克服上述缺點(diǎn)。腺病毒載體的miRNA不僅保留了每個(gè)miRNA天然的原始獨(dú)自雙臂結(jié)構(gòu)，并且腺病毒載體上的強(qiáng)啟動(dòng)子CMV非常有利于miRNA的大量表達(dá)。腺病毒載體容量大，安全系數(shù)高，腺病毒不會(huì)整合到宿主細(xì)胞的染色體當(dāng)中， 因而產(chǎn)生免疫原性極小， 而且腺病毒包裝容易操作， 所制備病毒滴度很高，病毒可以感染多種細(xì)胞類型，特別針對(duì)一些原代難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以達(dá)到理想的轉(zhuǎn)染效果，成為近來的首選方法[11- 12]。因此，腺病毒包裝的miRNA非常適合用于miRNA基因調(diào)控功能研究、miRNA基因治療等方面。

本研究構(gòu)建的重組穿梭質(zhì)粒pDC316- mCMV- miRNA- 140中包含加強(qiáng)性GFP表達(dá)框，可于感染24h后不同時(shí)間段觀察熒光表達(dá)。因此， 重組病毒載體在293AAV細(xì)胞中的包裝效率很容易通過熒光顯微鏡觀察， 也為重組病毒滴度測(cè)定提供便利; 特別是在帶有目的基因的重組腺病毒感染靶細(xì)胞時(shí)，可以直接通過觀察到目的基因轉(zhuǎn)入組織細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來確定目的基因的表達(dá)效果。

本研究利用Adeasy腺病毒包裝系統(tǒng)成功完成重組腺病毒pAd- has- miRNA- 140包裝與純化，收獲高滴度的重組腺病毒，隨后感染目的細(xì)胞，其高表達(dá)miRNA- 140。這為下一步進(jìn)行基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。特別是miRNA- 140的靶基因是HDAC4(組蛋白去乙?；?)， 通過抑制HDAC在骨肉瘤中的作用可能還具有一定的治療方面的應(yīng)用價(jià)值[13]。因此， 本研究成功制備了miRNA- 140重組腺病毒， 為進(jìn)行miRNA- 140與骨肉瘤耐藥作用機(jī)制以及miRNA- 140參與骨肉瘤疾病發(fā)病機(jī)制的研究創(chuàng)造了前提條件。

[參考文獻(xiàn)]

[1] WAHID F,SHEHZAD A,KHAN T,et al.MicroRNAs:synthesis,mechanism,function,and recent clinical trials[J].Biochim Biophys Acta,2010，1803(11):1231- 1243．

[2] FARAZI T A,HOELL J I,MOROZOV P,et al.microRNAs in Human Cancer[J].Adv Exp Med Biol,2013,774:1- 20．

[3] SONG B,WANG Y,XI Y,et al.Mechanism of chemoresistance mediated by miR- 140 in human osteosarcoma and colon cancer cells[J].Oncogene,2009,28(46):4065- 4074．

[4] NICOLAS F E,PAIS H,SCHWACH F,et al.Experimental identification of microRNA- 140 targets by silencing and overexpressing miR- 140[J].RNA,2008，14(12):2513- 2520．

[5] KOTA J,CHIVUKULA R R,O’DONNELL K A,et al.Therapeutic microRNA delivery suppresses tumorigenesis in a murine liver cancer model[J].Cell,2009,137(6):1005- 1017．

[6] 蔣森，趙亞萍，杜云翔.MiR- 1在腫瘤中的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2012，31(5)：648- 651．

[7] 蔣亮，劉春輝，許斌,等.miR- 146a通過抑制ROCK1基因的表達(dá)促進(jìn)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞的凋亡[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2015，34(3)：357- 360．

[8] OOM A L,HUMPHRIES B A,YANG C.MicroRNAs:novel players in cancer diagnosis and therapies[J].Biomed Res Int，2014,2014:959461．

[9] GUO X,XIA J,YAN J.Promoter methylated microRNAs:Potential therapeutic targets in gastric cancer (Review)[J].Mol Med Rep,2015,11(2):759- 765．

[10] GANDELLINI P,GIOVANNETTI E,NICASSIO F.MicroRNAs in cancer management:big challenges for small molecules[J].Biomed Res Int,2015，2015:982156．

[11] EINFELD D A,ROELVINK P W.Advances towards targetable adenovirus vectors for gene therapy[J].Curr Opin Mol Ther,2002,4(5):444- 451．

[12] LIU F,LI Q,ZHANG P et al.Role of adenovirus- mediated retinoblastoma 94 in the treatment of human non- small cell lung cancer[J].Mol Med Rep,2015,11(5):3349- 3353．

[13] TUDDENHAM L,WHEELER G,NTOUNIA- FOUSARA S,et al.The cartilage specific microRNA- 140 targets histone deacetylase 4 in mouse cells[J].FEBS Lett,2006,580(17)：4214- 4217．

The construction and identification of an adenoviral vector expressing mature miRNA- 140

HE Peng1，DUAN Li2

[1.DepartmentofStomatology，SouthernMedicalUniversityShenzhenHengshengHospital，Shenzhen518000，China;2.ShenzhenKeyLaboratoryofTissueEngineering，ShenzhenSecondPeople’sHospital(TheFirstHospitalAffiliatedtoShenzhenUniversity)，Shenzhen518035，China]

[Abstract]Objective:To construct an adenoviral vector expressing mature miRNA- 140. Methods: The target Hsa- miRNA- 140 gene amplified from human genome was digested and linked to the shuttle plasmid pDC316- mCMV- EGFP. The recombinant plasmid was confirmed and transfected into AAV- 293 cells for adenoviruses pAd- has- miRNA- 140 packaging. The obtained adenoviruses were used to infect target cells and the cellular expressions of has- miRNA- 140 were detected using fluorescence and quantitative PCR. Results: Has- miRNA- 140 containing the restriction sites was amplified and linked to the shuttle plasmid pDC316- mCMV- EGFP，which was successfully recombined with AdEasy.After packaging in AAV- 293 cells，the adenoviruses were obtained，which caused an increase of miRNA- 140 expression about 4.2±0.2 folds in osteosarcoma cells. Conclusion: The adenoviral vector expressing the mature miRNA- 140 is successfully constructed.

[Key words]miRNA- 140； AdEasy system； quantitative polymerase chain reaction； osteosarcoma cells

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01．002

[中圖分類號(hào)]Q782

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671- 6264(2016)01- 0006- 05

[作者簡(jiǎn)介]賀鵬(1973-)，男，湖南衡山人，主治醫(yī)師。E- mail:hp73514@sina.com

[基金項(xiàng)目]深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201003462)

[收稿日期]2015- 07- 20[修回日期] 2015- 09- 18

[引文格式] 賀鵬，段莉.miRNA- 140過表達(dá)腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016，35(1)：6- 10.

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