林桐，張啟國，吳鴻雁，張李玉，董海波，歐陽建

(1.南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院 血液科，江蘇 南京　210009；

2.南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院 病理科，江蘇 南京　210009)

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多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓組織中NF-κB/p65的表達(dá)與硼替佐米療效的關(guān)系

林桐1，張啟國1，吳鴻雁2，張李玉1，董海波1，歐陽建1

(1.南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院 血液科，江蘇 南京210009；

2.南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院 病理科，江蘇 南京210009)

[摘要]目的: 觀察NF- κB/p65在初發(fā)的多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma， MM)骨髓活檢組織中的表達(dá)與患者臨床特征及硼替佐米療效的關(guān)系。方法: 應(yīng)用改良的甲基丙烯酸甲基酯單體塑料包埋法進(jìn)行骨髓活檢組織制片，采用免疫組化法分別檢測59例初診MM和10例正常對照骨髓活檢組織中NF- κB/p65的表達(dá)情況，并分析NF- κB/p65與MM患者臨床特征及療效的關(guān)系。結(jié)果:(1) 59例MM患者中40.67%(24/59)NF- κB/p65高表達(dá)，對照組10例均為低表達(dá)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)在NF- κB/p65高表達(dá)患者中，含硼替佐米方案與不含硼替佐米方案療效差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(88.9% vs 26.7%， P=0.02)；但在NF- κB/p65低表達(dá)患者中，含硼替佐米方案與不含硼替佐米方案療效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(50% vs 23.8%， P=0.11)。結(jié)論: NF- κB/p65在MM骨髓組織中表達(dá)水平明顯升高，NF- κB/p65高表達(dá)的MM患者使用含硼替佐米的方案療效優(yōu)于未含硼替佐米治療者，MM患者骨髓組織NF- κB/p65表達(dá)水平可能成為預(yù)測硼替佐米治療MM療效的依據(jù)之一。

[關(guān)鍵詞]多發(fā)性骨髓瘤； NF- κB/p65； 免疫組織化學(xué)； 硼替佐米

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma， MM)是以骨髓中單克隆漿細(xì)胞惡性增殖和異常積聚為特征的腫瘤，迄今仍認(rèn)為是不可治愈的疾病，中位生存期為3~4年[1- 2]。使用傳統(tǒng)細(xì)胞毒藥物化療患者獲益不多，故深入研究MM發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用的因子，以便針對性地進(jìn)行藥物干預(yù)以提高臨床療效具有重大意義。目前已有硼替佐米等數(shù)種新藥用于臨床，療效有了很大提高。

NF-κB家族成員(p50/105， p52/100， p65/RelA， RelB， c- Rel)均相互形成二聚體來參與NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄活動。NF-κB通路可由細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、黏附分子、抗原受體、環(huán)境壓力和其他等激活。激活途徑有經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路兩種，經(jīng)典通路通常主要依賴于NF-κB抑制物激酶γ(IKKγ)調(diào)節(jié)的NF-κB抑制物激酶β(IKKβ)所激活的，主要由p50/p65二聚體參與，通常經(jīng)典通路較為多見。大量與腫瘤發(fā)生進(jìn)展相關(guān)的基因研究[3]突出了NF-κB通路激活在MM發(fā)病機(jī)制中的重要性，為通過抑制NF-κB通路激活來治療MM提供合理發(fā)展基礎(chǔ)[4- 5]。本研究通過觀察MM患者骨髓活檢組織中NF-κB/p65的表達(dá)情況分析其與各臨床變量的關(guān)系以及硼替佐米對NF-κB/p65高表達(dá)MM患者治療有效率的影響。

1資料與方法

1.1病例資料

選擇南京鼓樓醫(yī)院血液科2012年1月至2014年12月初診為MM的患者59例，所有患者均符合WHO 2008年MM診斷標(biāo)準(zhǔn)。臨床分期分別采用DS分期及ISS分期，中位年齡為60(33~80)歲，男27例，女32例。參照ISS分期標(biāo)準(zhǔn)，36例(62%)在診斷時(shí)處于Ⅲ期，16例(27%)處于Ⅱ期，7例(11%)處于Ⅰ期；參照D- S分期標(biāo)準(zhǔn)，49例(84%)在診斷時(shí)處于Ⅲ期，5例(8%)處于Ⅱ期，5例(8%)處于Ⅰ期；25例(43%)為IgG型，15例(25%)為IgA型，6例(10%)為IgD型，13例(22%)為輕鏈型；中位β2- 微球蛋白水平6466(1218~20000)μg·ml-1；肌酐水平正常(<133μmol·L-1)45例,占77%，高于正常(≥133μmol·L-1)14例,占23%；中位漿細(xì)胞比例21.9%(0.5%~90%)；FISH(熒光原位雜交)中，45例患者中發(fā)現(xiàn)19例存在1q擴(kuò)增，16例存在13q缺失；41例患者中發(fā)現(xiàn)10例p53缺失。23例患者予以含硼替佐米方案治療，包括PD、PTD、PTCD方案，其余36例患者予傳統(tǒng)藥物方案治療，包括VAD、CTD、VADT以及馬達(dá)蘭+潑尼松方案。

參照IMWG制定MM療效標(biāo)準(zhǔn)[6]，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進(jìn)展(PD)。平均4個(gè)療程后評估療效，CR+PR為治療有效組，未達(dá)PR為治療無效組。

對照組10例，其中健康造血干細(xì)胞捐贈者6例，淋巴瘤Ⅰ期患者4例，其骨髓細(xì)胞形態(tài)、病理及外周血象檢查均正常，中位年齡為42(24~52)歲。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本制備應(yīng)用我科研制的甲基丙烯酸甲基酯單體為主的包埋試劑盒NJ- Resin2011。配置A液成分(改良的MMA單體)：MMA單體100ml+過氧苯甲酰150mg+聚乙二醇(PEG400)12.5ml。配置B液成分(加速劑)：N，N二甲基苯胺1 ml+聚乙二醇(PEG400)8ml。均于髂后上棘局部麻醉后用B65- 01骨髓活檢針，取得活檢組織塊，大小為2 mm×(8～10) mm。所得標(biāo)本梯度乙醇脫水，然后放入改良的MMA單體A液中，-20℃過夜。將活檢組織塊置入1.5ml容量的塑料模具中，加入約1.5ml的改良MMA包埋劑A液，吸取3μl B液加入模具中，迅速將A、B兩液攪勻成全包埋液，將活檢組織塊置于模具底部中央位置，靜置于-20℃冰箱中待其聚合。聚合后制備3μm厚的切片，98~100℃熱水中展片，切片裱于帶電荷的玻片上，置丙酮中2h脫去塑料。

1.2.2免疫組化免疫組化方法為EnVison兩步法：一抗NF-κB/p65(貨號MAB3026，Millipore公司)，工作濃度為1∶50。免疫組化結(jié)果評分：NF-κB/p65陽性細(xì)胞的判斷及計(jì)數(shù)，以鏡下觀察到細(xì)胞核棕黃色為陽性細(xì)胞，在光鏡(×200)下觀察整個(gè)切片，隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)得出平均陽性百分率。標(biāo)準(zhǔn)如下：陽性細(xì)胞數(shù)0%為陰性(-)，≤10%為低水平表達(dá)(+)，<10%而≤50%為中等水平表達(dá)(++)，<50%而≤80%為較高水平表達(dá)(+++)，>80%為高表達(dá)(++++)。表達(dá)水平判斷標(biāo)準(zhǔn)：(-)～(+)為NF-κB/p65低表達(dá)；(++)～(++++)為NF-κB/p65高表達(dá)。所有患者的病理切片由兩位病理科醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立閱片。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1NF-κB/p65在不同骨髓活檢組織中的表達(dá)

59例MM中NF-κB/p65的高表達(dá)率為40.67%(24/59)，對照組為0，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1、2)。

A.對照組NF-κB/p65(-)； B.MM組NF-κB/p65(+++)

圖1NF-κB/p65在對照組和MM組骨髓活檢組織中的表達(dá)情況(×200)

Fig 1The expression of NF-κB/p65 in control and MM bone marrow biopsies(×200)

圖2對照組與MM組NF-κB/p65的表達(dá)情況比較

Fig 2NF-κB/p65 expression of control and MM patients

2.2MM各個(gè)臨床變量與NF-κB/p65表達(dá)結(jié)果的關(guān)系

MM患者ISS分期Ⅲ期患者高表達(dá)率為42.8%，Ⅰ、Ⅱ期高表達(dá)率為38.7%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；D- S分期Ⅲ期患者高表達(dá)率為42.8%，Ⅰ、Ⅱ期高表達(dá)率為30%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且兩組間漿細(xì)胞比例差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.3硼替佐米對NF-κB/p65高表達(dá)MM患者治療有效率的影響

59例多發(fā)性骨髓瘤患者治療方案不同，在NF-κB/p65高表達(dá)患者中，含硼替佐米方案治療組9例，不含硼替佐米方案治療組15例，兩組治療有效率分別為88.9%及6.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但在NF-κB/p65低表達(dá)患者中，含硼替佐米方案治療組(n=14)與不含硼替佐米方案治療組(n=21)治療有效率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(50%vs23.8%，P>0.05，圖3)。

表1NF-κB/p65的表達(dá)及與臨床變量的關(guān)系(n=59)

Tab 1The relationship between NF-κB/p65 expression and clinicopathologic factors of 59 cases of MM patients

臨床特征np65高表達(dá)組p65低表達(dá)組P值MM592435性別 男2715(62.5%)12(34.3%) 女329(37.5)23(65.7%)0.061年齡 <60歲299(37.5%)20(57.1%) ≥60歲3015(62.5%)15(42.9%)0.138ISS分期 Ⅰ、Ⅱ期3112(50.0%)19(54.3%) Ⅲ期2812(50.0%)16(45.7%)0.746D-S分期 Ⅰ、Ⅱ期103(12.5%)7(20.0%) Ⅲ期4921(87.5%)28(80.0%)0.451M蛋白/g·L-123.22±7.0824.77±4.160.841肌酐/μmol·L-1187.44±43.69118.45±27.470.189血紅蛋白/g·L-194.87±6.13104.41±4.980.232β2微球蛋白/μg·ml-17519.8±1617.55881.5±944.60.354漿細(xì)胞比例/%21.04±5.0222.55±4.540.827FISH 1q擴(kuò)增7/1712/280.912 13q缺失8/198/260.433 P53缺失4/1014/310.775

圖3中硼替佐米對治療有效率的影響

Fig 3effects of bortezomib in the treatment efficiency

3討論

本研究結(jié)果顯示，59例MM患者骨髓組織中NF-κB/p65高表達(dá)者占40.67%，低表達(dá)者占42.37%，零表達(dá)占16.94%，而對照組均為零表達(dá)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故MM患者骨髓組織中NF-κB/p65存在過表達(dá)的現(xiàn)象。原因可能為：(1) NF-κB信號分子突變，Annunziata等[4]系統(tǒng)地研究了突變的NF-κB信號分子，發(fā)現(xiàn)82%的MM樣本中表達(dá)高水平的NF-κB活化信號分子；(2) 作為NF-κB活化抑制劑，與正常人比較，MM患者中多態(tài)性的IκB基因發(fā)生頻率增加，提示MM中NF-κB活化的發(fā)生率增加[7]；(3) 能夠激活NF-κB通路的受體，如CD28，只在惡性漿細(xì)胞表面存在，而正常漿細(xì)胞不能表達(dá)[8]；(4) 骨髓瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間的直接接觸導(dǎo)致骨髓瘤細(xì)胞中NF-κB通路的激活[9]。NF-κB通路激活的MM細(xì)胞有助于通過提高生長、存活、黏附、血管生成和轉(zhuǎn)移從而致病。骨髓基質(zhì)細(xì)胞中NF-κB通路的激活也有利于MM的發(fā)病。

本研究發(fā)現(xiàn)，很多臨床變量在NF-κB/p65表達(dá)水平間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如MM各臨床分期均有NF-κB/p65高表達(dá)，Ⅰ、Ⅱ，Ⅲ期組間未見差異，可能提示NF-κB/p65在MM的發(fā)病機(jī)制中起了一定的作用。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)種通過阻斷NF-κB通路的激活來治療MM的藥物，包括硼替佐米、沙利度胺、雷那度胺和三氧化二砷等[10- 12]。這些NF-κB通路抑制劑作為單藥用于骨髓瘤細(xì)胞時(shí)，其安全劑量可能無法完全抑制其生長，然而，因?yàn)樗鼈冊谝欢ǔ潭壬弦种颇[瘤細(xì)胞生存，通過處理后的細(xì)胞可能對于其他細(xì)胞毒性藥物的敏感性增強(qiáng)，從而可以適當(dāng)減少此類藥物的劑量，達(dá)到協(xié)同作用的效果。在MM的治療中使用NF-κB通路抑制劑，可明顯增強(qiáng)傳統(tǒng)化療方案對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[13]。

由于IκBα是蛋白酶體的一種基質(zhì)，硼替佐米用于MM的治療機(jī)制之一為抑制NF-κB通路的激活，通過抑制IκBα的降解阻止p50/p65核易位發(fā)揮作用[14]。本研究選取了經(jīng)典途徑特有的家族成員NF-κB/p65，在其高表達(dá)患者中，含硼替佐米方案治療與不含硼替佐米方案治療緩解率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)；但在NF-κB/p65低表達(dá)患者中，含硼替佐米方案治療與不含硼替佐米方案治療短期緩解率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.11)。說明對NF-κB/p65高表達(dá)的MM患者優(yōu)先選用含硼替佐米的治療能取得較好的療效。但這一結(jié)果仍需進(jìn)一步證實(shí)。原因?yàn)椋?1) 該59例MM患者治療方案中的藥物如沙利度胺，也同樣具有阻斷NF-κB通路的作用；(2) 硼替佐米除了抑制NF-κB激活以外，也可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬等，這一反應(yīng)提示含硼替佐米的療法不一定可以成為高選擇性的治療策略[15]；(3) 雖然經(jīng)典通路較為多見，但MM中不能排除存在非經(jīng)典通路激活的可能，且近期有研究指出同時(shí)抑制NF-κB的經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路具有加強(qiáng)抗腫瘤活性、克服腫瘤微環(huán)境的增殖和抗凋亡作用[16- 17]；(4) 本研究中收集病例數(shù)較少，所得結(jié)果仍有片面性。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明59例MM中NF-κB/p65的高表達(dá)者占40.67%，單因素分析發(fā)現(xiàn)NF-κB/p65表達(dá)水平與臨床ISS分期、D- S分期、總療效等無關(guān)，與對照組比較，MM患者NF-κB/p65存在過表達(dá)的現(xiàn)象。對NF-κB/p65高表達(dá)的MM患者，應(yīng)優(yōu)先選用含硼替佐米的治療方案。但本研究樣本量較小，仍需擴(kuò)大病例數(shù)及對NF-κB非經(jīng)典通路特征性的家族成員進(jìn)行檢測分析，使結(jié)果更加完善。

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Expression of NF-κB/p65 associated with the efficacy of bortezomib in multiple myeloma

LIN Tong1，ZHANG Qi- guo1，WU Hong- yan2，ZHANG Li- yu1，DONG Hai- bo1，OUYANG Jian1

(1.DepartmentofHaematology，NanjingDrumTowerHospital，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210009，China;2.DepartmentofPathology，NanjingDrumTowerHospital，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210009，China)

[Abstract]Objective: To explore NF- κB/p65 expression in the bone marrow of newly diagnosed multiple myeloma (MM) and the relationship between it and the overall response rate after treatment. Methods: The bone marrow sections were made from plastic(methyl- methacrylate)- embedded bone marrow biopsies. The NF- κB/p65 expression of MM group and control group were detected by EnVison immunohistochemistry. The clinical significance of NF- κB/p65 was analyzed. Results: NF- κB/p65 was highly expressed in 40.67%(24/59) MM bone marrow biopsies， expression of all 10 patients in the normal control group were low， there was significant difference between the two groups (P<0.05). In patients of highly NF- κB/p65 expressed，the treatment response rate showed statistically significant difference between groups treated with bortezomib and without bortezomib (88.9% vs 26.7%， P=0.02)， but in patients with low expression of NF- κB/p65， the treatment response rate showed no significant difference in the two groups (50% vs 23.8%， P=0.11). Conclusion: The expression of NF- κB/p65 in MM bone marrow biopsies increases significantly. MM patients with high expression of NF- κB/p65 preferr the clinical benefit of bortezomib- based regimens. NF- κB/p65 expression level may form the basis for predicting the efficacy of bortezomib- based regimens．

[Key words]multiple myeloma; NF- κB/p65; immunohistochemistry; bortezomib

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01．009

[中圖分類號]R733.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)01- 0041- 05

[通信作者]歐陽建E- mail:oy626@sina.com

[作者簡介]林桐(1989-)，女，江蘇靖江人，在讀碩士研究生。E- mail:lintong_19890908@163.com

[收稿日期]2015- 07- 14[修回日期] 2015- 09- 22

[引文格式] 林桐，張啟國，吳鴻雁，等.多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓組織中NF-κB/p65的表達(dá)與硼替佐米療效的關(guān)系[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2016,35(1)：41- 45.

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